報告說 信息分析流 組組 組注 信息分析結(jié) 組組 K-mer分析估計組大 組組 組裝后組分 GC含量分 組注 注 非編碼RNA注 全組分析 數(shù)據(jù)................................................................................................................................ 解壓文 結(jié) 組 注 進 1.1標 描 RepBase為庫，利用軟件RepeatMasker對組進行重復(fù)序列注釋。 描述一個。如：Repbase() 指向某個參考文獻。如：以RepBase[1]為庫，利用RepeatMasker[2]對組進行重復(fù)序列注釋粗 repeat）和散在重復(fù)序列(Interpersedrepeat)兩大類。Denovo組裝分析流程。是否BACEST圖2.1組Denovo組裝分析流GLEANseqGeneDeDeGeneStatisticsStatistics組注釋GLEANseqGeneDeDeGeneStatisticsStatisticsStatisticsStatistics圖2.2組注釋分析首先，重復(fù)序列注釋是結(jié)合了基于RepBase庫（）的同源預(yù)測方法（軟件：RepeatMaskerRepeatProteinMask）和基于自身序列比對（RepeatModeler、Piler、RepeatScount）及重復(fù)序列特征（軟件：TrfLTR-FINDER）denovo從頭預(yù)測方法。編碼的結(jié)構(gòu)預(yù)測，通常會結(jié)合多種預(yù)測方法，如homolog同源預(yù)測（至少選兩到三個近源物種）、denovo從頭預(yù)測（軟件：Augustus、Genscan等）、cDNA/ESTGLEAN軟件的幫助下，將各種方法預(yù)測得到的集整合成一個非冗余的、更加完整的集。另外，RNA-seq數(shù)據(jù)通過Tophat比對和Cufflinks組裝得到的轉(zhuǎn)錄本，還被用來對GLEAN的集進行補充和完善，得到最終的集。然后借助于外源蛋白數(shù)據(jù)庫（SwissProt、TrEMBL、KEGG、InterPro和GO）對集中的蛋白進行功能注非編碼RNA的注釋過程中，根據(jù)tRNA的結(jié)構(gòu)特征，利用tRNAscan-SE軟件來尋找組中的tRNA序列；由于rRNA具有高度的保守性，因此可以選擇近緣物種的rRNABLASTN比對來尋找組中的rRNA；另外，利用Rfam的協(xié)方差模型，采用Rfam自帶的INFERNAL軟件可預(yù)測組上的miRNA和snRNA序列信息。 Allgeneset AllgenesetformultipleFiltergeneClustergeneClustergeneBlastpGetsingle-copyCalculate4DTVMultiplesequenceMultiplesequenceGetsupergene4-degeneratesitesandphase1WhetherprovidefossiltimeReconstructthephylogeneticCalculatedivergence2.3策略及原始數(shù)據(jù)量統(tǒng)利用樣品DNA來構(gòu)建不同插入長度的文庫。根據(jù)我們制定的策略，構(gòu)建文庫的插入長度分別是：170bp、500bp、800bp、2Kb、5Kb、10Kb、20Kb。在得到不同插入長度的文庫之后，我們用Hiseq2000對 。最后我們得到了7個文庫、14個lane的數(shù)據(jù)，總數(shù)據(jù)量為Solexa

Insert

3.1AverageTotal

注：此表中，組大小以1.1Gb計算數(shù)據(jù)過濾處為了減少錯誤對組裝造成的影響，我們對Illumina-Pipeline測得的原始數(shù)據(jù)做了一系列校正和過Pair-end Insert

3.2數(shù)據(jù)量的統(tǒng)計AverageTotal

Depth

Depth(X)Solexa

注：此統(tǒng)計表為通過數(shù)據(jù)過濾流程處理之后的數(shù)據(jù)量的統(tǒng)計表,組大小以1.1Gb計[1]RuiqiangLI,etal.Thesequenceanddenovoassemblyofthegiantpandagenome.Nature463,311-K-mer分析估計組大在組組裝前，為了用所得的read信息估計組特征，我們采用基于K-mer的分析方法來估計組大小和雜合率等，即從一段連續(xù)序列中迭代地選取長度為K個堿基的序列，若read長度為merK，那么可以得到L-K+1個K-mer，這里，我們?nèi)176543210 3.117-mer深度頻數(shù)分布圖，圖中橫坐標為深度（depth），縱坐標為各深度下的K-mer種類占所有K-mer種類的比3.317-mer Genome Used Used 使用高質(zhì)量數(shù)據(jù)32.92Gb，逐堿基取17-mer獲得深度頻數(shù)分布圖，其深度峰值根據(jù)公式GenomeSize=K-mer_num/Peak_depth，可以估算出該物種的組大小約為1.1Gb。[1]RuiqiangLI,etal.Thesequenceanddenovoassemblyofthegiantpandagenome.Nature463,311-小片段數(shù)據(jù)糾

錯誤會導(dǎo)致新的K-mer出現(xiàn)，一般來說這些新的K-mer頻數(shù)都是比較低的。當(dāng)量足夠大的情況下，認為頻數(shù)低的K-mer是由錯誤導(dǎo)致的。對這些低頻的K-mer所在的reads進行校正，稱為數(shù)據(jù)

[1]Li,R,etal.Denovoassemblyofhumangenomeswithmassivelyparallelshortreadsequencing.GenomeRes.20:265-272我們主要是使用SOAPdenovo軟件來完成組組裝，處理的對象就是前面完成過濾糾錯后的reads TotalSize TotalNumber(>=100bp) Total 注：此表中，包括拼接的scaffold和最后的contig的N50~N90的長度信息，總長度和最長的長度信息，統(tǒng)計信息不包括長度短于100bp的片段。上表中統(tǒng)計的contig和scaffold的序列長度信息是基于最后補洞之后的序列進行的。由“表

參考文獻RuiqiangLI,etal.Thesequenceanddenovoassemblyofthegiantpandagenome.Nature463,311-317Li,R,etal.Denovoassemblyofhumangenomeswithmassivelyparallelshortreadsequencing.GenomeRes.20:265-272MartenBoetzer,etal.Scaffoldingpre-assembledcontigsusingSSPACE.BioinformaticsAdvanceAccess組裝后組分GC含量分根據(jù)GC_depth分布圖可以看出是否有明顯的GC偏向，也可以判斷是否存在細菌污染等情況。圖3.2GC含量與深度關(guān)系分布圖，橫坐標是GC含量，縱坐標是平均深度。以10kb為窗口無overlap計算其GC含量和根據(jù)此圖可以看出組整體的深度較高，組GC分布相對集中，整個GC分布范圍內(nèi)覆蓋40X以上。圖3.3相關(guān)物種的組GC含量分布,橫坐標為GC含量，縱坐標為該GC下窗口（bin）數(shù)目所占比例。即將組裝的組序列以500bp為窗口，窗口之間有250bp的overlap，計算每個窗口的GC含量深度分采用SOAPaligner將過濾之后的reads比對回拼接的組序列上，然后根據(jù)比對結(jié)果統(tǒng)計每個堿基被覆蓋的次數(shù)，從而可以得到各種深度的堿基占全組的百分比，覆蓋深度小于10所占的比率低3%。組組裝結(jié)果（1）常區(qū)域覆蓋度評–3.5利用已發(fā)布的BAC序列或Fosmid

（2）區(qū)覆蓋度評把已公布的EST或轉(zhuǎn)錄組序列作為query序列map到拼接完成的組序列上，檢查拼接序列對已知表表3.6利用已公布的EST序列

Coveredby

With>90%Sequencein

With>50%Sequencein

98% 利用已公布的EST序列對 98%3.2組注重復(fù)序列注重復(fù)序列是組的重要組成部分，主要包括兩大類：分別為串聯(lián)重復(fù)序列（Tandemrepeat）和散在重復(fù)序列(Interpersedrepeat)。其中串聯(lián)重復(fù)序列包括有微序列，小序列等等；散在重復(fù)序列又稱轉(zhuǎn)座子元件，包括以DNA-DNADNA轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotransposon)。注釋結(jié)果如下3.7 Repeat %ofDenovo注：TRF是通過TRF軟件找到的組序列中的串聯(lián)重復(fù)序列；RepeatMasker和RepeatProteinMask是基于RepBase庫，分別通過RepeatMasker和RepeatProteinMask軟件注釋組序列得到的轉(zhuǎn)座子元件；Denovo是利用軟件RepeatModeler（組小于600M時，一般用LTR-FINDER、Piler和RepeatScout進行預(yù)測；大于600M時則用RepeatModeler進行預(yù)測，LTR-FINDER可選可不選）得到的最終的序列文件作為庫，通過RepeatMasker軟件注釋組序列得到的結(jié)果；Total是以上各種方法得到的結(jié)果，去掉它們之間 RepBase TE De Combined

%in Length %in

%in

%in注：RepBaseTEs和TEproteins都是基于RepBase庫分別通過RepeatMasker和RepeatProteinMask軟件注釋組得到的轉(zhuǎn)座子元件；Denovo是通過denovo預(yù)測方法RepeatModeler（組小于600M時，一般用LTR-FINDER、Piler和RepeatScout進行預(yù)測；大于600M時則用RepeatModeler進行預(yù)測，LTR-FINDER可選可不選）得到的重復(fù)序列為庫，利用軟件RepeatMasker得到的組中重復(fù)序列的結(jié)果；CombinedTEs是整合以上三種方法并去冗余后的結(jié)果。中注釋到的TE序列與RepBase中相應(yīng)序列的度；縱坐標是該度下的TE序列在組中所占的百分比；不同的TE圖3.1四種TE序列度分布圖2。Denovo方法預(yù)測得到的TE的度分布圖，橫坐標是注釋得到的TE序列與denovo庫中對應(yīng)的重復(fù)序列之間的度；縱坐標是該度下的TE序列占整個組的百分比；不同的TE以不同的參考文獻Jurka,J.,Kapitonov,V.V.,Pavlicek,A.,Klonowski,P.,Kohany,O.,Walichiewicz,J.(2005)RepbaseUpdate,adatabaseofeukaryoticrepetitiveelements.CytogenticandGenomeResearch110:462-467G.Benson.Tandemrepeatsfinder:aprogram yzeDNAsequences.NucleicAcidsResearch.27,573-580.PriceA.L.,JonesN.C.andPevznerP.A.Denovoidentificationofrepeatfamiliesinlargegenomes.Bioinformatics.21,i351-i358(2005).A.F.A.Smit,R.Hubley&P.GreenRepeatMaskeratEdgar,R.C.&Myers,E.W.Piler:identificationandclassificationofgenomicrepeats.Bioinformatics21,i152-158Xu,Z.&Wang,H.Ltr_finder:anefficienttoolforthepredictionoffull-lengthltrretrotransposons.Nucl.AcidsRes.35,W265-268(2007).3.2.2注注釋包括結(jié)構(gòu)注釋和功能注釋兩部分，我們首先通過各種方法預(yù)測的位置及結(jié)構(gòu)，然后再對GenetranscriptlengthAverageCDSlength(bp)exonAverageexonlength(bp)intronlengthDe Final注：該表中的轉(zhuǎn)錄本不含UTR區(qū)域表表3.10 集

>=20%overlap >=50%overlap >=80%overlap 注：P：表示有denovo預(yù)測的結(jié)果支持；C：表示有cDNA/EST預(yù)測數(shù)據(jù)支持；H：表示有同源預(yù)測數(shù)據(jù)支持；single表示只有一次數(shù)據(jù)支持；more表示有多次數(shù)據(jù)支持；overlap：表示最終的集分別與各種預(yù)測結(jié)果的CDS 圖3.7整合RNA-Seq數(shù)據(jù)的集信息統(tǒng)計。Identical：集中來源于GLEAN有RNA-Seq數(shù)據(jù)支持（與RNA-Seq中蛋白序列長度一致、相似度100%）的數(shù)；Part：來源于GLEAN，有RNA-Seq數(shù)據(jù)支持（與RNA-Seq中蛋白序列相似度>=95%，覆蓋度>=90%）的數(shù)；All：來源于GLEAN且同時具有Identical和Part兩類支持的數(shù)；No：來源于GLEAN，無RNA-Seq數(shù)據(jù)支持或者低序列相似度的數(shù)；CUFF：來源于RNA-Seq的數(shù)。圖3.8結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果集統(tǒng)計圖（與近緣物種的元件比較）,window指橫坐標上每個點所代表的長度 Percent 參考文獻Kent,W.J.BLAT-theBLAST-likealignmenttool.GenomeRes.12,Birney,E.,Clamp,M.&Durbin,R.GeneWiseandGenomewise.GenomeRes.14,988–995MarioSe,OliverKeller,IrfanGunduz,AlecHayes,StephanWaack,BurkhardMorgenstern(2006)"AUGUSTUS:abinitiopredictionofalternativetranscripts"NucleicAcidsResearch,34:W435-W439.TrapnellC,WilliamsBA,PerteaG,MortazaviA,KwanG,vanBarenMJ,SalzbergSL,WoldBJ,PachterL.TranscriptassemblyandficationbyRNA-Seqrevealsunannotatedtranscriptsandisoformswitchingduringcelldifferentiation.Nat.Biotechnol.28:511-515(2010).Majoros,W.H.,Pertea,M.&Salzberg,S.L.TigrScanandGlimmerHMM:twoopensourceabinitioeukaryoticgene-Bioinformatics20,2878-9Bairoch,A.&Ap,R.TheSWISS-PROTproteinsequencedatabaseanditssupplementTrEMBLin2000.Nucl.AcidsRes.28,45-48(2000).Zdobnov,E.M.&Ap,R.InterProScan-anintegrationplatformforthesignature-recognitionmethodsinInterPro.Bioinformatics17,847-848(2001).Ashburner,M.etal.GeneOntology:toolfortheunificationofbiology.NatGenet25,25-29Kanehisa,M.&Goto,S.KEGG:kyotoencyclopediaofgenesandgenomes.NucleicAcidsRes28,27-30非編碼RNA注有重要的生物學(xué)功能。miRNA可降解其靶或抑制靶翻譯成蛋白質(zhì)，具有沉默的功能。tRNA3.12非編碼RNA Averagelength Totallength %of

參考文獻Griffiths-Jones,S.etal.Rfam:annotatingnon-codingRNAsincompletegenomes.NucleicAcidsRes33,D121-4ToddM.LoweandSeanR.Eddy.tRNAscan-SE:aprogramforimproveddetectionoftransferRNAgenesingenomicsequence.NucleicAcidsRes(1997).3.3.1鑒 GenesAverageper注：注：Unclusteredgenes指的是該物種特有的gene的個數(shù);Uniquefamilies圖3.9XXX,XXX,XXX,XXX,XXX,XXX和XXX組之間的同源數(shù)目比圖3.10XXX,XXX,XXX和XXX組中同源數(shù)目Venn系統(tǒng)發(fā)育分我們用單拷貝構(gòu)建物種發(fā)育樹。不同物種的變異速率和該物種的大小或者世代周期有關(guān)，分化時間估3.12多個物種的分化時間估算.樹枝上的藍色數(shù)字表示估算出的分化年代（millionyearsago,Mya），XXX-XXX分化時（X~Xmillionyearsago）作為校正時間，來自已的文獻組共線性分共線性片段指同一個物種內(nèi)部或者兩個物種之間，由于（組、或者大片段復(fù)制）或者物種分化而產(chǎn)生的大片段的同源性現(xiàn)象。在該同源片段內(nèi)部，在功能上以及排列順序上都是圖的形式可視化的表現(xiàn)出來，對兩組數(shù)據(jù)通過比對分析，發(fā)現(xiàn)他們之間存在的共線性關(guān)系。

#of

3.14XXXXXX共線性結(jié)果統(tǒng)#ofAverageCollinearGenesinPer