一、膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理二、全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析三、單通道記錄數(shù)據(jù)的分析四、突觸放電活動(dòng)數(shù)據(jù)的分析PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014內(nèi)容1一、膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理PatchclamptrainiPatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理一、基線的調(diào)零二、壞點(diǎn)的去除三、濾波四、數(shù)據(jù)文件內(nèi)部/之間的數(shù)學(xué)運(yùn)算2PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理一、基線的調(diào)零

基線的確認(rèn)

全細(xì)胞記錄基線易確認(rèn)，單通道記錄基線不易確認(rèn)。

單通道開放時(shí)間較長(zhǎng)

所記錄的時(shí)間較短

同時(shí)開放的通道數(shù)目較多且長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)開放確定通道電流的方向：電流方向向上，最負(fù)向是基線位置，反之亦然。如何確定：膜片兩側(cè)液體、鉗制電位單通道電流基線的確認(rèn)如果通道開放時(shí)電流向上，則基線在最下面的位置基線通道開放3PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理4PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

基線不在零點(diǎn)的原因

封接電阻的改變：漏電流

失調(diào)電位的存在：偏移、漂移

噪聲的干擾：交流干擾高通濾波的影響：對(duì)記錄線的起始部位產(chǎn)生影響5PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

基線調(diào)零方法打開Analyze/Adjust/Baseline（1）Subtractmeanof（去除均值法）：適用于去除直流偏移。（2）Subtractslopeof（去除斜率法）：適合于去除持續(xù)線性漂移。（3）Subtractfixedvalue（去除固定值法）：適用于去除直流偏移。數(shù)值有正負(fù)之分。（4）Adjustmanually（手工調(diào)零法）：適合于單通道電流的基線或基線漂移無(wú)規(guī)律。6PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理坐標(biāo)零點(diǎn)坐標(biāo)零點(diǎn)EpochA段（1）Subtractmeanof（去除均值法）（2）Subtractslopeof（去除斜率法）7PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理（3）Subtractfixedvalue（去除固定值法）

（4）Adjustmanually（手工調(diào)零法）8PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

基線調(diào)零的注意事項(xiàng)（1）有些只相對(duì)值（如電流幅度的變化值），不需要將基線調(diào)零。但多數(shù)情況需要基線調(diào)零，建議都要進(jìn)行基線調(diào)零。（2）對(duì)于基線變動(dòng)復(fù)雜的數(shù)據(jù)，基線調(diào)零可能會(huì)用到上述的幾種方法。（3）對(duì)于某些基線變動(dòng)，Clampfit中的基線調(diào)零方法可能也無(wú)法準(zhǔn)確調(diào)零。建議最好在采集數(shù)據(jù)時(shí)就設(shè)法調(diào)整好基線。9PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理Clampfit演示基線調(diào)零方法10PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014二、壞點(diǎn)的去除壞點(diǎn)產(chǎn)生的原因

刺激偽跡：給標(biāo)本施加刺激時(shí)產(chǎn)生。

電容瞬變電流：電容的充放電反應(yīng)。

瞬時(shí)脈沖干擾（Glitch）：打開電源開關(guān)（日光燈、儀器設(shè)備開啟時(shí)）手機(jī)來(lái)電：一過性高頻。人手靠近記錄探頭：高幅、高頻。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理11PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014壞點(diǎn)的賦值

（1）Datavalueatcursor1：Cursor1的數(shù)值。

（2）Meanbetweencursor1..2：Cursor1-2之間均值。

（3）Meanbetweencursor3..4：Cursor3-4之間均值。

（4）Straight-linefitbetweencursor1..2：Cursor1-2之間的直線擬合值。

（5）Fixedvalue(pA/mV)：輸入一個(gè)固定的數(shù)值。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理12PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理Clampfit演示去除壞點(diǎn)13PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014注意事項(xiàng)

（1）壞點(diǎn)太多時(shí)，應(yīng)在記錄前予以去除。（2）壞點(diǎn)持續(xù)時(shí)間短，如果出現(xiàn)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的壞點(diǎn)，則數(shù)據(jù)要廢棄。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理14PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014三、濾波信號(hào)采集前的濾波

全細(xì)胞通道電流記錄：1-2kHz

全細(xì)胞突觸活動(dòng)記錄：10kHz

單通道電流記錄：10kHz動(dòng)作電位記錄：10kHz膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理15PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014信號(hào)采集后的濾波

膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理16PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

Lowpass

Highpass

Bandpass

Notch

ElectricalInterference

Clampfit濾波類型

膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理17PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

Lowpass

最為常用。Clampfit根據(jù)采樣定理與Nyquist定理自動(dòng)算出f-3dB范圍并顯示在該框底部。7種類型：（1）8-poleBessel：數(shù)據(jù)失真小，普遍用于時(shí)域數(shù)據(jù)。（2）Boxcar：數(shù)碼濾波器，用于時(shí)域數(shù)據(jù)。當(dāng)前數(shù)據(jù)點(diǎn)及其前后一些數(shù)據(jù)點(diǎn)（取決于Smoothingpoints，取3-99中的奇數(shù)）的平均值賦予當(dāng)前數(shù)據(jù)點(diǎn)，完成濾波。Smoothingpoints值越大，數(shù)據(jù)幅度削減越大。

（3）Gaussian：數(shù)碼濾波器，同Boxcar，但當(dāng)前數(shù)據(jù)點(diǎn)在平均值中所占的比例較大。（4）RC(8-coincident-pole)：用于時(shí)域數(shù)據(jù)。（5）RC(single-pole)：用于時(shí)域數(shù)據(jù)。（6）8-poleButterworth：用于頻域數(shù)據(jù)。（7）8-poleChebyshev：用于頻域數(shù)據(jù)。

膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理18PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理Clampfit演示Lowpass濾波19PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

Highpass又稱交流耦合（ACCoupling），可削弱低頻信號(hào)而通過高頻信號(hào)。Clampfit提供兩種：8-poleBessel，單極RC

采用-f-3dB，Clampfit自動(dòng)計(jì)算出f-3dB范圍并顯示在該框底部。最常見的是在神經(jīng)元上進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)記錄時(shí)使用高通濾波器，它可降低膜電位的低頻振蕩對(duì)突觸電流的干擾。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理20PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理Clampfit演示Highpass濾波21PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

Bandpass相當(dāng)于低通濾波與高通濾波的交叉，需要同時(shí)設(shè)定高通濾波與低通濾波。高通濾波的f-3dB不能高于低通濾波的f-3dB。帶通濾波用于欲記錄的信號(hào)頻率較為單一和固定時(shí)，對(duì)其它頻率的噪聲進(jìn)行濾波。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理22PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

Notch帶阻濾波：削弱某一特定頻率（如50Hz交流）信號(hào)。中心頻率（Centerfrequency）：10-3,000Hz。頻率寬度（–3dBwidth）：頻率寬度。-3dBwidth越窄，濾波需要的數(shù)據(jù)點(diǎn)越多，濾波效果越好。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理23PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理Clampfit演示Notch濾波24PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

ElectricalInterference（EI）電干擾濾波器（Electricalinterferencefilter,EI）為數(shù)碼濾波器?？赏瑫r(shí)去除50Hz及其諧波（100Hz、150Hz等）的復(fù)雜交流噪聲。Harmonicsfrom1to：用于設(shè)定欲去除的交流諧波的最高數(shù)目，最大數(shù)目為20（對(duì)應(yīng)于1kHz），一般去除第1-3個(gè)就夠了。Cyclestoaverage：數(shù)目越大，-3dB頻率寬度越窄，濾波效果越好，但需時(shí)越長(zhǎng)。Referencefrequency：選50Hz。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理25PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014EI所需最少數(shù)據(jù)點(diǎn)的計(jì)算舉例濾波器所需最少數(shù)據(jù)點(diǎn)＝（采樣頻率/50Hz）×Cyclestoaverage若采樣頻率＝10kHz，則一個(gè)50Hz正弦波周期的采樣點(diǎn)數(shù)＝10kHz/50＝200點(diǎn)若設(shè)定Cyclestoaverage＝10，則需要的最少采樣點(diǎn)數(shù)＝2,000點(diǎn)采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)不夠的話，將不能清除諧波干擾。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理26PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014四、數(shù)據(jù)文件內(nèi)部/之間的數(shù)學(xué)運(yùn)算

Analyze/AverageTraces平均文件內(nèi)任意幾條相同的Trace，獲得平均后的一條Trace。要求：

Clampex軟件的Fixed-lengthevents、Episodicstimulation和High-speedoscilloscope模式。

重復(fù)記錄的信號(hào)，時(shí)程必須固定不變。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理27PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

降低信號(hào)噪聲信號(hào)頻率譜與噪聲頻率譜一致或有重疊時(shí)，濾波不行。平均Trace的原理：設(shè)有N條Trace，則（見表）：先累加所有N條Trace，

此時(shí)信號(hào)幅度增大為原來(lái)的N倍，而噪聲卻只增大為原來(lái)的√N(yùn)倍。然后再除以Trace條數(shù)N，

信號(hào)幅度不發(fā)生大的變化，而噪聲幅度卻降低為原來(lái)的1/√N(yùn)。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理28PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理Clampfit演示AverageTraces功能29PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

Analyze/SegmentedAverage可對(duì)幾個(gè)Trace中的某一相同時(shí)段（如EpochA）或Cursor1-2之間的時(shí)間段進(jìn)行平均，平均后的文件通常用于Analyze/SubtractControl功能中的ControlFile。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理30PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

Analyze/Arithmetic對(duì)文件內(nèi)的任何Trace進(jìn)行加減乘除等運(yùn)算，使原來(lái)的Trace得到新值。如t3=t1+t2，t3=2t1+3t2Results窗口中的該功能可對(duì)不同Column的數(shù)據(jù)進(jìn)行運(yùn)算，得到新的Column的數(shù)值。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理31PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

Analyze/AverageFiles對(duì)幾個(gè)文件進(jìn)行平均。例如在進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要將幾個(gè)采樣文件相應(yīng)的每一個(gè)Trace進(jìn)行平均。平均后的文件會(huì)自動(dòng)生成，文件名為Average000-999.abf。僅適用于EpisodicStimulation、High-speedoscilloscope模式的數(shù)據(jù)；Protocol設(shè)置必須一致。同樣具有降低噪聲的作用。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理32PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理Clampfit演示AverageFiles功能33PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

Analyze/SubtractControl兩個(gè)文件中所有相應(yīng)的Trace進(jìn)行相減，可用于去除漏電流或分離某種通道電流。要求兩個(gè)文件要采用相同的Protocol來(lái)采集（信號(hào)數(shù)目、Sweep數(shù)目與長(zhǎng)短、信號(hào)單位、采樣頻率）。Testfile為“大”文件——“被減數(shù)”，ControlFile為“小”文件——“減數(shù)”。Multiplycontroltracesby:將ControlFile中的Trace乘以該倍數(shù)，然后再?gòu)腡estfile中減除。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理34PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理Clampfit演示SubtractControl功能35PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014注：如需要，可用Analyze/DataReduction或Interpolation功能使采樣頻率變?yōu)橐恢?。若Testfile中的Signal或Sweep數(shù)少于Controlfile，后者多余的Signal或Sweep將不被使用。反之，若Testfile中的Signal或Sweep數(shù)大于Controlfile，后者最后一個(gè)Signal或Sweep將被反復(fù)使用。若Testfile中的Sweep長(zhǎng)度小于Controlfile，后者Sweep中多余的點(diǎn)將不被使用。反之，若Testfile中的Sweep長(zhǎng)度大于Controlfile，后者Sweep中最后一個(gè)點(diǎn)將被反復(fù)使用。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理以Testfile為準(zhǔn)36PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

Analyze/ConcatenateFiles將在同一條件下獲得的數(shù)據(jù)文件并成一個(gè)文件。同一條件是指相同的采集模式/采樣頻率/采樣時(shí)間/信號(hào)個(gè)數(shù)連接后的文件會(huì)自動(dòng)生成:Concatenate000-999.abf。膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理37PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜片鉗實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理Clampfit演示ConcatenateFiles功能38PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析一、離子通道的激活曲線二、離子通道的I-V曲線三、離子通道的衰減四、離子通道的失活曲線五、量效曲線39PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014膜兩側(cè)電壓差ΔVm改變，激活離子通道，用激活曲線描述。

反映通道開啟的速度及難易程度。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析一、離子通道的激活曲線40PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014給予細(xì)胞一系列脈沖電壓來(lái)記錄全細(xì)胞電流，作通道的激活曲線：X軸——脈沖電壓VmY軸——全細(xì)胞通道電導(dǎo)g/gmaxBoltzmann方程擬合全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析41PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014g：全細(xì)胞通道激活電導(dǎo)gmax：全細(xì)胞通道最大激活電導(dǎo)Vm：不同的去極化（或超極化）脈沖電壓V1/2：通道激活50%時(shí)的脈沖電壓k：斜率因子（反映激活速度快慢，k越大，激活速度越慢）全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析Boltzmann方程42PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014設(shè)：f(V)=gImax=gmax=1Vmid=V1/2V=VmVc=kC=0則即為前述的激活曲線方程：全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析Clampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann,charge-voltage方程43PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理（如基線調(diào)零、濾波、選擇用于分析的Sweep數(shù)目等）。

測(cè)量不同去極化脈沖電壓下全細(xì)胞電流的峰值I（pA）。

計(jì)算全細(xì)胞電導(dǎo)。g＝I/(Vm－Vrev)

對(duì)全細(xì)胞電導(dǎo)g進(jìn)行標(biāo)化：g/gmax，gmax=Imax/(Vm-Vrev)。作點(diǎn)圖

最后用激活曲線方程對(duì)散點(diǎn)圖進(jìn)行擬合全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析離子通道激活曲線制作步驟44PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析Clampfit演示激活曲線的制作45PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析幾點(diǎn)說明（1）通過激活曲線的左移或右移以及半失活電壓的變化等指標(biāo)可以判斷藥物對(duì)通道開啟過程的影響。（2）若要反映一類通道的激活特點(diǎn)或?qū)Σ煌M數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，需要有細(xì)胞例數(shù)上的要求，要求出平均g/gmax值與標(biāo)準(zhǔn)差，再作激活曲線。（3）通道反轉(zhuǎn)電位可通過Nernst方程計(jì)算出來(lái)，也可直接測(cè)試出來(lái)，后者更準(zhǔn)確。46PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014離子通道電流-電壓關(guān)系曲線（I-V曲線）：

反映通道：激活過程、閾電位、反轉(zhuǎn)電位、整流特性給予連續(xù)變化的步階/斜坡脈沖電壓Vm（范圍大，最好跨越反轉(zhuǎn)電位），測(cè)通道電流大小I，作I-V曲線：X軸——VmY軸——I藥物可影響通道激活或衰減，使I-V曲線形狀發(fā)生改變。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析二、離子通道的I-V曲線47PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

用Analyze/QuickGraph/I-V作I-V曲線適用于脈沖電壓為歩階（方波）形式的記錄數(shù)據(jù)。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析48PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析Clampfit演示用QuickGraph/I-V作I-V曲線49PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

注意事項(xiàng)（1）通道未開放時(shí)，電流應(yīng)該為零。因此要對(duì)基線進(jìn)行細(xì)致的調(diào)零，可能要對(duì)每個(gè)Trace都進(jìn)行基線調(diào)零。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析50PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014（2）若要在一個(gè)細(xì)胞上測(cè)量多次，可選擇Clampex中EditProtocol的Run功能，也可用Analyze/AverageFiles功能進(jìn)行文件間的平均，得到某一個(gè)細(xì)胞的電流平均幅度值。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析51PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014（3）測(cè)量同一種類多個(gè)細(xì)胞的I-V曲線，需要對(duì)電流幅度標(biāo)化。原因：細(xì)胞大小不同，通道電流幅度不同。對(duì)于一個(gè)球形細(xì)胞，膜電容Cm＝πd2/100(pF)（d為細(xì)胞直徑(μm)）

例子：若細(xì)胞直徑d=20μm，其膜電容Cm=12pF。電流密度：I/Cm，I/Cm-V曲線Cm值的獲得：（a）封接過程直接獲得（b）OnlineStatistics窗口采集Cm，最后獲得平均Cm值I/Imax-V曲線。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析52PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014（4）如果從鉗制電位開始去極化（或超極化），在I-V曲線上應(yīng)不包含鉗制電位這個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析Vhold=-60mV53PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

用Analyze/QuickGraph/Tracevs.Trace作I-V曲線適用于脈沖電壓為斜坡（Ramp）形式的記錄數(shù)據(jù)。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析54PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析Clampfit演示用QuickGraph/Tracevs.Trace作I-V曲線55PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

注意事項(xiàng)用（1）Cursor1、2的位置要放置準(zhǔn)確，不要由于放置的誤差導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤。為了更好、更準(zhǔn)確地放置Cursor，應(yīng)該：（a）在采集時(shí)設(shè)計(jì)好Protocol。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析不好好56PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014（b）應(yīng)該以電流線（而不是Waveform電壓線）為準(zhǔn)設(shè)置Cursor。因?yàn)殡娏骶€滯后全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析1電流線Waveform22157PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014（2）可通過選擇對(duì)話框中的Append，將兩條I-V曲線作在一個(gè)圖中。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析58PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

通道在激活因素（一般為去極化）持續(xù)存在條件下的失活——衰減（Decay）

衰減的指標(biāo)：（1）時(shí)間常數(shù)；（2）10-90%衰減時(shí)間。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析三、離子通道的衰減CurrentWaveform59PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014衰減的時(shí)間常數(shù)通道電流的衰減過程可用單指數(shù)方程或者雙指數(shù)方程擬合，獲得衰減的時(shí)間常數(shù)。Clampfit軟件中“Exponential,standurd”指數(shù)擬合方程：全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析τ：衰減的時(shí)間常數(shù)i=2時(shí)，為雙指數(shù)方程，擬合后獲得τ1和τ2兩個(gè)時(shí)間常數(shù)值。60PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析Clampfit演示衰減的擬合61PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

10-90%衰減時(shí)間打開Analyze/Statistics窗口，除設(shè)置其他選項(xiàng)外，要在Measurement中勾上Risetime,From10To90%。OK后，在Window/Results窗口中可查看到結(jié)果。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析62PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

給予細(xì)胞膜一個(gè)電壓刺激，持續(xù)一段時(shí)間后，開放了的通道會(huì)逐漸失活，再給予電壓刺激時(shí)，失活的通道將不再開放——穩(wěn)態(tài)失活（Steady-stateinactivation）。用失活曲線反映。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析四、離子通道的失活曲線2nA10ms-50mVConditioningpulsesTestingpulsesVh=-90mV63PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014失活曲線采用雙脈沖設(shè)置的Protocol來(lái)獲得數(shù)據(jù)條件脈沖——將膜鉗制在不同的電位水平，使相應(yīng)部分通道處于完全失活狀態(tài)。測(cè)試脈沖——檢測(cè)未失活通道的電流大小。X軸——條件脈沖的電壓數(shù)值Y軸——測(cè)試脈沖的電流大小用Boltzmann方程擬合全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析2nA10ms-50mVConditioningpulsesTestingpulsesVh=-90mV64PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014I：不同條件脈沖電壓下測(cè)試脈沖誘發(fā)的電流大小Imax：不同條件脈沖電壓下測(cè)試脈沖誘發(fā)的最大電流Vm：不同條件脈沖電壓V1/2：通道失活50%時(shí)的條件脈沖電壓k：斜率因子（反映失活速度快慢，k越大，失活速度越慢）全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析Boltzmann方程VmImax/2V1/20Imax65PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析Clampfit中的Boltzmann方程：Boltzmann,charge-voltage方程設(shè)：f(V)=IImax=－1Vmid=V1/2V=VmVc=kC=1則即為前述的失活曲線方程：66PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

失活曲線制作步驟（1）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析前的處理：基線調(diào)零、濾波等。（2）測(cè)量不同條件脈沖下的測(cè)試脈沖誘發(fā)的全細(xì)胞電流峰值（I）。以測(cè)試脈沖的全細(xì)胞最大電流峰值Imax為1，對(duì)其它電流標(biāo)化，計(jì)算出I/Imax。（3）以Vm為x軸，I/Imax為y軸，作點(diǎn)圖。（4）最后用失活曲線方程對(duì)散點(diǎn)圖進(jìn)行擬合。打開Clampfit中的Fit窗口，選擇Boltzmann,charge-voltage方程。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析67PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析Clampfit演示失活曲線的制作68PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014幾點(diǎn)說明（1）通過失活曲線的左移或右移以及半失活電壓的變化等指標(biāo)可以判斷藥物對(duì)通道失活過程的影響。（2）同通道激活曲線一樣，若要比較不同組之間的差異，作失活曲線也需要有細(xì)胞例數(shù)（n）上的要求，要求出平均I/Imax值與標(biāo)準(zhǔn)差，再作失活曲線。（3）在作失活曲線時(shí)，脈沖電壓的設(shè)定要注意：條件脈沖時(shí)間要設(shè)定得足夠長(zhǎng)，以使通道在某一去極化水平的失活達(dá)到完全，這需要根據(jù)通道的失活特點(diǎn)來(lái)設(shè)定。

Na+離子通道：衰減快，條件脈沖20ms寬

L型Ca2+離子通道：衰減緩慢，條件脈沖的寬度十幾秒條件脈沖與測(cè)試脈沖的間隔不能設(shè)定得過長(zhǎng)，以防止失活的通道恢復(fù)，影響測(cè)試脈沖的測(cè)量。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析條件脈沖測(cè)試脈沖69PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

概念量效曲線：X軸——藥物劑量/濃度大小Y軸——藥理效應(yīng)強(qiáng)弱閾濃度半效濃度EC50最大效能效價(jià)強(qiáng)度全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析五、量效曲線70PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

Clampfit中的Hill方程：Hill(4parameterlogistic)方程（1）觀察藥物對(duì)某種受體/通道電流的誘發(fā)/增強(qiáng)作用時(shí)：Imax：藥物作用后通道的最大電流幅度Imin：藥物作用前的電流幅度C50：半效濃度EC50[X]：所施加的藥物濃度h：Hill系數(shù)設(shè)通道電流的幅度為I，將Y軸設(shè)為I/Imax，擬合時(shí)，設(shè)Imax=1。若觀察配體對(duì)受體通道誘發(fā)電流的情況，則擬合后，Imin接近0。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析

Clampfit中的Hill方程：Hill(4parameterlogistic)方程（1）觀察藥物對(duì)某種受體/通道電流的誘發(fā)/增強(qiáng)作用時(shí)：Imax：藥物作用后通道的最大電流幅度Imin：藥物作用前的電流幅度C50：半效濃度EC50[X]：所施加的藥物濃度h：Hill系數(shù)設(shè)通道電流的幅度為I，將Y軸設(shè)為I/Imax，擬合時(shí)，設(shè)Imax=1。若觀察配體對(duì)受體通道誘發(fā)電流的情況，則擬合后，Imin接近0。71PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014（2）觀察藥物對(duì)某種受體/通道電流的阻斷作用時(shí)：Imax：最大濃度藥物作用后的電流幅度Imin：藥物作用前的電流幅度C50：半抑制濃度IC50[X]：所施加的藥物濃度h：Hill系數(shù)設(shè)通道電流的幅度為I，將Y軸設(shè)為I/Imin。擬合時(shí)，設(shè)Imin=1。若藥物對(duì)通道電流完全阻斷，擬合后，Imax接近0。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析72PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014（3）觀察配體誘發(fā)受體通道的電流時(shí)，因配體施加前通道不開放，可以采用Clampfit中的Hill,Langmuir方程對(duì)量效曲線進(jìn)行擬合：設(shè)：i=1C=0C50：半效濃度EC50[X]：所施加的藥物濃度h：Hill系數(shù)全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析73PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

例1.GABA誘發(fā)的GABA-A受體電流的量效曲線制作全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析GABA:0.5、1、5、10、50、100μmol/L74PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析Clampfit演示GABA電流的量效曲線75PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

例2.荷包牡丹堿Bicuculline對(duì)GABA-A受體電流抑制作用的量效曲線制作全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析Bicuculline:0,0.1,1,10,100μmol/LGABA:10μmol/L76PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析Clampfit演示Bicuculline的量效曲線77PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014

幾點(diǎn)說明藥物濃度的選擇：（1）要含有閾濃度和最大效能濃度。（2）按一定倍比關(guān)系：如1、2、5、10、20、50、100等。（3）至少4個(gè)濃度。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析78PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014藥物施加原則：（1）按照從低到高濃度的順序施加。在用浴槽灌流給藥時(shí)要將前次藥物沖洗掉，然后再給下一個(gè)濃度；在用培養(yǎng)皿時(shí)（難以灌流）每次施加的藥量要少，防藥物累加。（2）為獲得穩(wěn)定的量效曲線，藥物從低到高的幾個(gè)濃度最好在同一個(gè)細(xì)胞上施加。因此要求有合適的給藥裝置和高質(zhì)穩(wěn)定的全細(xì)胞記錄。（3）正式實(shí)驗(yàn)前，需要先期做預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定每個(gè)藥物濃度的給藥間隔時(shí)間，確保藥物作用不受受體失敏的影響。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析79PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和藥物特點(diǎn)選擇給藥方法：（1）配體或通道的激動(dòng)劑的施加要求快速、微量的給藥裝置；（2）昂貴的藥物一般不采用灌流給藥，而采用壓力噴射給藥；（3）受體拮抗劑可與配體一起施加，也可預(yù)先加入拮抗劑；（4）用培養(yǎng)皿時(shí)，因灌流置換液體困難，要采用壓力噴射給藥方法；（5）直接用加樣槍向培養(yǎng)皿或浴槽內(nèi)滴加藥物的方法，只用于簡(jiǎn)單的藥物定性；（6）離子電泳的給藥方法適合于能夠離子化的藥物。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析80PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014Clampfit的作圖效果不理想，不適合正式發(fā)表文章。采用作圖軟件Origin制作量效曲線：選擇Analysis/Non-linearCurveFit中的Logistic方程。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析81PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014實(shí)驗(yàn)一般要求有細(xì)胞的個(gè)數(shù)（n），獲得平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

標(biāo)準(zhǔn)差可用作圖軟件Origin顯示出來(lái)：在數(shù)據(jù)表窗口，選擇Column/SetasYError。全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析82PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014不同藥物量效曲線的比較要求：選擇相同的濃度兼顧閾濃度與最大效能濃度。將兩個(gè)量效曲線作在一起的方法：Clampfit——在制作第2個(gè)量效曲線時(shí)選擇Analyze/AppendtoGraph功能來(lái)制作。Origin——采用在數(shù)據(jù)表直接輸入數(shù)據(jù)的方法將幾條量效曲線作在一個(gè)圖中。以某藥物最大誘發(fā)電流來(lái)標(biāo)化其他藥物例子：Nic誘發(fā)最大電流=100%ACh誘發(fā)電流與之比較全細(xì)胞記錄數(shù)據(jù)的分析83PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析一、單通道電導(dǎo)的測(cè)算二、單通道開放概率的分析三、多通道開放概率的分析四、單通道I-V曲線五、單通道開放時(shí)間分布的直方圖84PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析單通道電導(dǎo)概念單通道電導(dǎo)（G）指通道完全開放（Fullopening）時(shí)，流經(jīng)單通道的電流（i）與通道兩側(cè)電壓差（鉗制電位與通道反轉(zhuǎn)電位的差值ΔV）的比值，即：G＝i/ΔV電導(dǎo)的單位是西門子（Siemens,S），一般通道電導(dǎo)多為pS級(jí)，少數(shù)通道電導(dǎo)較大，可達(dá)nS級(jí)（1nS＝1pA/mV）。一、單通道電導(dǎo)的測(cè)算i(pA)ΔV(mV)85PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析

亞開放狀態(tài)（Substate）不完全開放狀態(tài)，電流幅度小。

NMDA受體：兩個(gè)開放狀態(tài)（50pS主開放、40pS亞開放）

人工純化通道蛋白突變體：常有亞開放狀態(tài)UnitarycurrentClosingDwelltimeOpeningDwelltimeSubstate*****86PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析閃爍現(xiàn)象（Flicking）。通道的高速開放與關(guān)閉導(dǎo)致通道開放或關(guān)閉持續(xù)時(shí)間太短的現(xiàn)象。包括：（1）通道高速短時(shí)開放；（2）通道在開放時(shí)高速短時(shí)關(guān)閉。***87PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析單通道電導(dǎo)的測(cè)算方法（1）簡(jiǎn)單粗略的方法：找到基線，觀測(cè)單通道電流幅度峰值，并除以膜片兩側(cè)的電壓差與反轉(zhuǎn)電位的差值，就得到單通道電導(dǎo)G。例：膜兩側(cè)電壓差（鉗制電位）Vm=30mV反轉(zhuǎn)電位Vrev=0mV測(cè)得電流幅度i=100pA則單通道電導(dǎo)G=100pA/(30-0)mV=3.33nS該方法相對(duì)粗糙，但可快速觀察電導(dǎo)的大致變化。88PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析（2）斜率電導(dǎo)(Slopeconductance)：通過單通道I-V曲線求得（見后）。89PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析（3）直方圖擬合法：擬合電流幅度分布，計(jì)算出單通道平均電導(dǎo)。

高斯（Gaussian）方程對(duì)單通道電流幅度直方圖進(jìn)行擬合。Clampfit中的高斯方程：橫軸x：電流幅度的bin值縱軸f(x)：檢測(cè)的事件數(shù)目μ：?jiǎn)瓮ǖ离娏鞣鹊钠骄郸遥簡(jiǎn)瓮ǖ离娏鞣鹊臉?biāo)準(zhǔn)差A(yù)、C：系數(shù)i＝1時(shí)，一極高斯方程

G＝μ/ΔV90PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析

Clampfit演示用Histogram功能和高斯擬合測(cè)算單通道電導(dǎo)91PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析注意事項(xiàng)如果通道開放概率太低（只有很少的幾個(gè)開放事件），則擬合會(huì)失真，此時(shí)需要延長(zhǎng)采樣記錄時(shí)間以獲得更多的開放事件。測(cè)算單通道電導(dǎo)時(shí)應(yīng)選擇單通道開放的峰值（Level1的峰值）。亞開放狀態(tài)多時(shí)，會(huì)在單通道電流幅度峰值與基線峰值之間形成亞開放狀態(tài)的峰值，據(jù)此可測(cè)算出亞開放電導(dǎo)。閃爍現(xiàn)象多會(huì)使單通道電流幅度曲線峰值的左右不對(duì)稱，影響電導(dǎo)的測(cè)算。升高檢測(cè)事件的閾值或限制事件持續(xù)時(shí)間，可去除閃爍現(xiàn)象。如果記錄的數(shù)據(jù)中都是閃爍現(xiàn)象，沒有完全開放事件，則無(wú)法測(cè)算電導(dǎo)。在人工質(zhì)膜實(shí)驗(yàn)中，這種情況多表明通道蛋白純化過程有問題。無(wú)論上述哪種方法，都需要先確定正確的基線，并對(duì)膜片漏電流進(jìn)行去除，同時(shí)還要有一定的例數(shù)（膜片數(shù)）要求。92PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析二、單通道開放概率的分析分析開放概率之前，要先對(duì)開放事件進(jìn)行檢測(cè)。單通道事件的檢測(cè)（1）事件檢測(cè)前的準(zhǔn)備工作

基線調(diào)零、壞點(diǎn)去除、濾波等。（2）對(duì)檢測(cè)參數(shù)進(jìn)行設(shè)定（右圖）（3）進(jìn)行事件檢測(cè)93PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析

Clampfit演示單通道開放事件的檢測(cè)94PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析

單通道開放概率分析實(shí)例以機(jī)械敏感性MscL通道為例，單通道開放概率Po的計(jì)算過程如下：（1）打開單通道數(shù)據(jù)文件，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理（2）進(jìn)行事件檢測(cè)（3）計(jì)算Po（4）作壓力-單通道開放概率關(guān)系曲線（5）對(duì)壓力-單通道開放概率關(guān)系曲線進(jìn)行擬合Pressure-Po關(guān)系曲線95PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析Clampfit中的擬合方程：Boltzmann,charge-voltage設(shè)：f(V)=Po，單通道開放概率Vc=1/α，通道對(duì)負(fù)壓的敏感度（mmHg），擬合獲得的重要指標(biāo)V=P，施加的負(fù)壓值Vmid=P1/2，通道50%開放時(shí)的壓力值，擬合獲得的重要指標(biāo)Imax=1，以通道100%開放為1C=0，Po的位移設(shè)為0則上述方程可以寫成右側(cè)的Boltzmann方程：96PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析

Clampfit演示單通道開放概率Po的計(jì)算97PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析注意：?jiǎn)瓮ǖ栏怕史治龅那疤崾牵耗苡^察到膜片上全部通道開放的情況，進(jìn)而知道膜片上通道的最大數(shù)目。98PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析三、多通道開放概率

NPo的概念膜片上通道沒有全部開放，通道總數(shù)N未知，Po無(wú)法計(jì)算，只能計(jì)算NPo——多通道開放概率。單通道開放概率Po=NPo/N。壓力—Npo曲線用Boltzmann方程擬合。99PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析擬合壓力—NPo曲線的Boltzmann方程：

NPo：多通道開放概率NPomax：觀察到的所有開啟通道的最大開放概率=觀察到的通道數(shù)α：其倒數(shù)為通道對(duì)負(fù)壓的敏感度（mmHg）P：施加的負(fù)壓值。P1/2：通道50%開放時(shí)的壓力值。

擬合后，獲得P1/2和1/α。100PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析不同組NPo的比較不同膜片NPo的平均不同膜片通道數(shù)不同，NPo和NPomax都不會(huì)相同。求NPo/NPomax（NPomax：給藥前后兩次記錄中最大的NPo）。不同組比較方法：以壓力-NPo曲線為例。

（1）獲得一個(gè)膜片給藥前后不同負(fù)壓條件下的NPo，求出NPo/NPomax。（2）求出所有膜片上的NPo/NPomax，得到藥物施加前、后的兩條壓力-NPo曲線。（3）對(duì)曲線進(jìn)行Boltzmann擬合，比較兩組的P1/2和1/α。101PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析例子鉗制電位=10mV，施加壓力=-68mmHg，獲得NPocontrol，然后給予糜蛋白酶(Chymotrypsin,300μg/ml)，獲得NPochymotrypsin。本例NPomax=4。求出該膜片的NPocontrol/NPomax和（NPochymotrypsin/NPomax）。求出不同膜片上的NPocontrol/NPomax和NPochymotrypsin/NPomax，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。Vm=-10mVPressure=0mmHg4321Level102PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析單通道I-V曲線的概念與意義通單道電流I大小與膜片兩側(cè)電壓差大?。ㄣQ制電位Vm）之間的關(guān)系曲線。X軸：膜鉗制電位Vm（mV）Y軸：?jiǎn)瓮ǖ离娏鱅（pA）意義：反轉(zhuǎn)電位（Vrev）、斜率電導(dǎo)（Gs）。藥物會(huì)影響通道性質(zhì)，改變I-V曲線的形狀和位置。四、單通道I-V曲線I(pA)Vm(mV)103PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析

I-V曲線的制作在Clampex中獲得不同歩階電壓（Vm）下通道電流I，保存為數(shù)據(jù)文件（.abf）。在Clampfit中打開該文件，開始制作I-V曲線：（1）對(duì)數(shù)據(jù)基線調(diào)零、壞點(diǎn)去除、濾波。（2）用Histogram功能和高斯擬合測(cè)算每個(gè)Sweep的單通道平均電流值I。（3）將平均電流值I與相應(yīng)的歩階電壓Vm輸入到Results窗口空白表格中。（4）用CreateGraph作圖。（5）作回歸曲線：選擇“Straightline,standard”作為回歸方程。（6）擬合結(jié)果：斜率電導(dǎo)m。Straightline,standard方程：104PatchclamptrainingclassApr.單通道I-V曲線的制作A,

顯示膜片在不同歩階電壓下通道電流的變化.膜片兩側(cè)液體相同.B,I-V曲線，反轉(zhuǎn)電位為0mV，回歸后單通道斜率電導(dǎo)Gs=3.34nS.數(shù)據(jù)來(lái)自脂質(zhì)體上構(gòu)建的細(xì)菌機(jī)械敏感性MscL通道，施加的負(fù)壓穩(wěn)定在-70mmHg.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析A100pA250ms＋60mV＋50mV＋40mV＋30mV＋20mV＋10mV0mV－10mV－20mV－30mV－40mV－50mV－60mVBG＝3.34nS(pA)(mV)105單通道I-V曲線的制作PatchclamptrainiPatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析

注意如下幾點(diǎn)：如果膜片上含有不止

1個(gè)通道，且通道的開放概率太高，沒有單個(gè)通道開放的情況出現(xiàn)，則無(wú)法進(jìn)行回歸。解決辦法：（1）如果標(biāo)本是人工質(zhì)膜，應(yīng)降低通道蛋白嵌入量，進(jìn)而降低膜片上通道數(shù)目；（2）如果觀察的是配體門控性離子通道，應(yīng)該降低配體的使用濃度。106PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析避免亞開放事件、閃爍事件被計(jì)入內(nèi)。測(cè)量多個(gè)膜片，獲得樣本量n，求出平均的I-V曲線。

由于膜片上單通道電流幅度的大小不受細(xì)胞大小的影響，故不用標(biāo)化即可進(jìn)行平均。

107PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析單通道開放時(shí)間的分析首先要作出通道開放時(shí)間的事件頻數(shù)直方圖，然后選擇合適的指數(shù)方程對(duì)其擬合，求出開放時(shí)間分布的時(shí)間常數(shù)τ值（平均開放持續(xù)時(shí)間）。五、單通道開放時(shí)間分布的直方圖108PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析普通直方圖X軸：通道開放時(shí)間Dwelltime(ms)，bin值Y軸：檢測(cè)的事件數(shù)目，可寫成：EventNumberCountNumberEvents/BinEvents/xms對(duì)數(shù)直方圖——可見通道較快速的時(shí)間常數(shù)X軸：Logdwelltime(ms)，bin值Y軸：事件數(shù)目的平方根?？蓪懗桑篠quarerootcount（N）Frequency（Squarerootscale）Events（Squareroot）/binSquarerootofevents/binDwellTime(ms)Events/2msSquarerootevents/(60/Decade)LogDwellTime(ms)109PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析單通道開放時(shí)間分布的直方圖制作及擬合（1）單通道事件的檢測(cè)（2）用FastGraph功能制作單通道開放時(shí)間分布的直方圖（3）Clampfit擬合方程：Exponential,logprobability

τ為單通道平均開放時(shí)間。（4）Analyze/FittingResults擬合結(jié)果：?jiǎn)瓮ǖ榔骄_放時(shí)間τ值110PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析

Clampfit演示單通道開放時(shí)間分布的直方圖制作111PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014單通道記錄數(shù)據(jù)的分析幾點(diǎn)說明（1）擬合的曲線呈偏斜的鐘形，曲線峰值為τ。（2）若存在多個(gè)峰值，表明通道開關(guān)時(shí)間具有多個(gè)狀態(tài)，此時(shí)應(yīng)該采用多指數(shù)形式擬合，獲得多個(gè)τ值。（3）設(shè)α和β分別為開放與關(guān)閉的速率常數(shù)，則：α＝1/τo（τo為開放時(shí)間分布的時(shí)間常數(shù)）β＝1/τc（τc為關(guān)閉時(shí)間分布的時(shí)間常數(shù)）（4）藥物或不同鉗制電位等因素可能會(huì)影響開放速率。Squarerootevents/(60/Decade)LogDwellTime(ms)112PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014突觸放電活動(dòng)數(shù)據(jù)的分析一、突觸自發(fā)活動(dòng)的特點(diǎn)二、突觸電流的檢測(cè)三、突觸電流的分析113PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014突觸放電活動(dòng)數(shù)據(jù)的分析一、突觸自發(fā)活動(dòng)的特點(diǎn)

興奮性突觸活動(dòng)（1）微小興奮性突觸后電流（mEPSC）：突觸前膜Glu隨機(jī)量子釋放引起的突觸后膜反應(yīng)。

頻率增高：Glu隨機(jī)量子釋放頻率增加幅度增高：Glu量子同時(shí)釋放數(shù)目增加不受TTX影響114PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014突觸放電活動(dòng)數(shù)據(jù)的分析（2）自發(fā)興奮性突觸后電流（sEPSC）：突觸前膜由自發(fā)AP誘發(fā)的Glu釋放引起的突觸后膜反應(yīng)。頻率增高：Glu量子釋放數(shù)目增加幅度增高：同一時(shí)刻突觸前遞質(zhì)釋放總量增加突觸后膜受體反應(yīng)性增高和/或受體數(shù)目增多TTX完全抑制115PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014突觸放電活動(dòng)數(shù)據(jù)的分析400pA250ms（3）自發(fā)動(dòng)作電流（Spontaneousactioncurrent,sAC）：由突觸前膜自發(fā)動(dòng)作電位誘發(fā)的Glu量子釋放達(dá)到較大數(shù)量時(shí)，突觸后膜在產(chǎn)生的sEPSC基礎(chǔ)上就引發(fā)了sAC，可被TTX完全抑制。116PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014突觸放電活動(dòng)數(shù)據(jù)的分析

抑制性突觸活動(dòng)（1）微小抑制性突觸后電流（mIPSC）（2）自發(fā)抑制性突觸后電流（sIPSC）產(chǎn)生機(jī)制：分別與mEPSC和sEPSC一致mIPSC不受TTX影響，sIPSC被TTX阻斷由GABA介導(dǎo)250ms100pA117PatchclamptrainingclassApr.PatchclamptrainingclassApr.23-25,2014突觸放電活動(dòng)數(shù)據(jù)的分析二、突觸電流