第二章雞胚接種技術(shù)第二章雞胚接種技術(shù)1一、概況1911年Rous和Murphy首先應(yīng)用雞胚培養(yǎng)研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。1938年Goodpasture和Burnet等應(yīng)用雞胚繁殖病毒、Cox應(yīng)用卵黃囊培養(yǎng)立克次體。一、概況1911年Rous和Murphy首先應(yīng)用雞胚培養(yǎng)研究2

雞胚培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)：雞胚的組織分化程度低，可選擇適當(dāng)途徑接種，病毒易復(fù)制，感染病毒的膜和液體含大量病毒。雞胚是一整體，有神經(jīng)血管的分布及臟器的構(gòu)造。來(lái)源充足，操作簡(jiǎn)單，通常是無(wú)菌的，對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體。雞胚接種技術(shù)分析課件3

雞胚培養(yǎng)法的缺點(diǎn)：一般的病毒通常不使雞胚產(chǎn)生特異性的感染指征。卵黃中常常含有抗家禽病原體的母體抗體。某些細(xì)菌、衣原體和病毒能夠從感染的母雞傳遞到雞胚。通常雞胚含有白血病病毒。在雞食物中加入抗菌素，母雞吃后會(huì)傳遞給雞胚，雞胚就會(huì)產(chǎn)生對(duì)立克次體和衣原體感染的抵抗。雞胚培養(yǎng)法的缺點(diǎn)：4

第一節(jié)雞胚的結(jié)構(gòu)與生理

雞胚是由三個(gè)胚層發(fā)育起來(lái)的，即外胚層、中胚層和內(nèi)胚層，它們構(gòu)成胚胎的組織與器官。（約10日齡雞胚的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖）

第一節(jié)雞胚的結(jié)構(gòu)與生理

雞胚是由三個(gè)胚層發(fā)育起來(lái)的5雞胚接種技術(shù)分析課件6卵殼與殼膜卵殼位于最外層的堅(jiān)硬殼層；殼膜位于卵殼的下層，允許氣體和液體分子交換，因此培養(yǎng)雞胚需一定的濕度和氣體。氣室功能主要是呼吸和調(diào)節(jié)壓力。絨毛尿囊膜殼膜之下，主要是胚胎的呼吸器官。羊膜胚胎的最內(nèi)層包被，含羊水，胚胎在其中。卵殼與殼膜7尿囊腔位于絨毛尿囊腔和羊膜之間，胚胎排泄器官含5－20ml尿囊液，含大量的尿酸鹽，為減少沉淀，鹽水稀釋再4℃保存。卵黃囊主要營(yíng)養(yǎng)的儲(chǔ)藏場(chǎng)所，為胚胎提供營(yíng)養(yǎng)。卵白外于卵的銳端，為胚胎發(fā)育晚期提供營(yíng)養(yǎng)。尿囊腔8第二節(jié)雞胚的孵育和檢查受精雞卵的供給—沒(méi)有受到病毒和細(xì)菌的污染如新城雞瘟病毒、布氏桿菌等；—培養(yǎng)立克次體和衣原體，不能來(lái)自食用抗生素的雞群。第二節(jié)雞胚的孵育和檢查受精雞卵的供給9雞胚的孵育—溫度為38～39℃；—濕度為40％-70％；—翻蛋：防止蛋白粘連，促進(jìn)羊膜運(yùn)動(dòng)和空氣流通；—通風(fēng)：排出CO2和吸入O2。雞胚的孵育10

檢卵

—血管：活胚可見(jiàn)清晰的血管，有時(shí)可見(jiàn)血管搏動(dòng)，死胚血管模糊成淤血帶或淤血塊。

—胎動(dòng)：活胚可見(jiàn)明顯的自然運(yùn)動(dòng)，尤其在轉(zhuǎn)動(dòng)胚胎時(shí)，死胚見(jiàn)不到任何胎動(dòng)，胚胎發(fā)紅像出血樣，有的呈現(xiàn)黑塊。

—絨毛尿囊膜發(fā)育界限：發(fā)育好的雞胚可見(jiàn)密布豐滿(mǎn)的血管網(wǎng)，也就是絨毛尿囊膜，死胚則見(jiàn)不到這一現(xiàn)象。檢卵11雞胚接種技術(shù)分析課件12第三節(jié)雞胚接種途徑及方法（一）羊膜腔接種

應(yīng)用于從臨床材料中分離流感病毒等，病毒感染后可收集羊水和尿囊液。第三節(jié)雞胚接種途徑及方法（一）羊膜腔接種13接種步驟與方法將10~12日齡的雞胚在檢卵燈上照視，標(biāo)記氣室及胚胎的位置。消毒氣室部位的蛋殼，在氣室頂端鉆出一約10mm×6mm的長(zhǎng)方形裂痕，注意勿鉆破殼膜。再次消毒鉆孔區(qū)后，用滅菌的小鑷子除去長(zhǎng)方形卵殼和外層殼膜，并滴加滅菌液體石蠟一滴于下層殼膜上，使其透明，以便觀察胚胎的位置。將注射器刺向胚胎的腭下胸前，以針頭撥動(dòng)下顎及腿，當(dāng)進(jìn)入羊膜腔內(nèi)時(shí)，可看到雞胚隨針頭的撥動(dòng)而動(dòng)，此時(shí)可注入O.1～0.2ml病毒液。拔出針頭，孔區(qū)消毒后用沾有碘酒通過(guò)火焰的小塊膠布將卵殼的窗口封住，于33～35℃孵育48～72h，要保持雞胚鈍端朝上。接種步驟與方法14羊膜腔接種法

羊膜腔接種法15雞胚接種技術(shù)分析課件16解剖與收獲收獲前雞胚須置4℃冰箱6h或過(guò)夜，但不能放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起散黃)。如急于收獲亦可置-20℃冰箱lh左右。預(yù)冷的目的是，將雞胚凍死，使血液凝固，避免收獲時(shí)流出紅細(xì)胞，并同尿囊液的病毒發(fā)生凝集，造成病毒滴度下降。病毒通過(guò)胚胎機(jī)體后被排泄入尿囊腔，因此當(dāng)羊水過(guò)少時(shí)，可用同胚少量尿囊液沖洗羊膜腔并吸取該洗液。解剖與收獲17（二）絨毛尿囊膜接種常用于牛痘病毒、天花病毒、單純皰疹病毒的分離，因?yàn)檫@些病毒在絨毛尿囊膜上可形成肉眼可見(jiàn)的斑點(diǎn)狀或痘皰狀病灶。另外，病毒可在絨毛尿囊膜上進(jìn)行滴定，因?yàn)楦腥拘圆《绢w粒的數(shù)目可以通過(guò)產(chǎn)生的斑和痘的數(shù)目來(lái)計(jì)算。該方法還可用于抗病毒血清的滴定試驗(yàn)，即在有抗體存在的情況下，痘皰形成受到抑制。（二）絨毛尿囊膜接種18將孵育l0~13日齡的雞胚標(biāo)記氣室、胎位，于與胚胎略近氣室端卵殼上劃一等邊三角形。消毒氣室頂端及記號(hào)處，用開(kāi)孔器在記號(hào)處的卵殼上開(kāi)一三角形裂痕，不可弄破下面的殼膜，同時(shí)在氣室頂端鉆一小孔。輕輕揭去卵殼，露出殼膜，在殼膜上滴一滴生理鹽水，用針尖循卵殼膜纖維方向劃破一隙，勿傷及緊貼的絨毛尿囊膜。用針尖刺破氣室小孔處的殼膜，再用橡皮乳頭緊按氣室小孔向外吸氣，此時(shí)鹽水小滴即可自裂隙流至絨毛尿囊膜上，從而使絨毛尿囊膜下陷而形成人工氣室。在卵殼的窗口滴0.05~0.1ml病毒液于絨毛尿囊膜上，然后將旋轉(zhuǎn)雞胚使接種物擴(kuò)散到整個(gè)絨毛膜尿囊膜上。在卵殼的窗口周?chē)渴?，用消毒膠布封口。將雞胚保持人工氣室在上的位置，33~35℃繼續(xù)培養(yǎng)48～72h。接種步驟與方法將孵育l0~13日齡的雞胚標(biāo)記氣室、胎位，于與胚胎略近氣室端19絨毛尿囊膜接種法絨毛尿囊膜接種法20解剖與收獲用剪刀沿人工氣室邊緣將膜剪下，放入加有滅菌生理鹽水的培養(yǎng)皿內(nèi)，觀察病灶形狀或用于傳代，或用50％甘油保存。同時(shí)作無(wú)菌培養(yǎng)。

解剖與收獲21（三）尿囊腔接種廣泛應(yīng)用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的適應(yīng)和傳代培養(yǎng)，這些病毒被接種到尿囊腔后，可在內(nèi)皮細(xì)胞中復(fù)制，復(fù)制的病毒被釋放到尿囊液中，因此，在尿囊液中含有大量的病毒。（三）尿囊腔接種22取9~11日齡的雞胚，標(biāo)記氣室與胚胎位置，并在胚胎面與氣室交界之邊緣上約1mm處避開(kāi)血管作一標(biāo)記，此即為注射點(diǎn)。將雞胚豎放在卵杯上，鈍端向上。消毒氣室的蛋殼，用開(kāi)孔器鉆開(kāi)一長(zhǎng)約2mm小口。再次消毒鉆孔區(qū)，接種病毒液0.1～0.2ml，將針頭刺入孔內(nèi)，經(jīng)尿囊膜入尿囊腔，注入病毒液。消毒后用石蠟溶化封孔，于33～35℃孵卵器孵育48～72h，；于接種后24h內(nèi)死亡者為非特異性死胚應(yīng)棄去。接種步驟與方法取9~11日齡的雞胚，標(biāo)記氣室與胚胎位置，并在胚胎面與氣室交23尿囊腔接種法尿囊腔接種法24解剖與收獲接種后收獲病毒的時(shí)間根據(jù)不同病毒而異，甲型流感病毒一般培養(yǎng)44～48h，乙型流感病毒培養(yǎng)72h。收獲前雞胚置4℃冰箱6h或過(guò)夜，但不能放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。消毒氣室的卵殼，用滅菌剪刀剪去氣室部的卵殼，用無(wú)菌鑷子撕去氣室部殼膜，并翻開(kāi)到卵殼邊上。將雞卵傾向胚胎一側(cè)，用滅菌毛細(xì)吸管通過(guò)絨毛尿囊膜進(jìn)入尿囊腔，吸出尿囊液。一般一個(gè)雞胚可收獲5～10ml的尿囊液。若操作時(shí)損傷了血管，則病毒會(huì)吸附在紅細(xì)胞上，尿囊液則無(wú)。經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)后，可在4℃或低溫保存。解剖與收獲25（四）卵黃囊接種主要用于蟲(chóng)媒病毒、衣原體及立克次體等的分離和繁殖。這些大的病原體主要在卵黃囊的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)速度很快，立克次體染色后也可看到。（四）卵黃囊接種26取5～8日齡雞胚，標(biāo)記氣室和胚胎位置，垂直放置在卵架上，鈍端朝上，消毒氣室端。用開(kāi)孔器在氣室中央的卵殼上鉆一小孔，用帶有6號(hào)針頭的1m1注射器將樣品從小孔處沿胚的縱軸迅速刺入約3cm，注入0.2～0.5ml待接種的病毒于卵黃囊內(nèi)，隨后用膠帶或溶化的石蠟封孔。置孵化箱內(nèi)繼續(xù)孵育3～8d，時(shí)間長(zhǎng)短應(yīng)根據(jù)病毒或立克次體的種類(lèi)而定，每天翻卵2次，棄掉24h內(nèi)死亡的雞胚(但東方型和西方型馬腦炎可能在接種后15～24h內(nèi)死亡)。接種步驟與方法取5～8日齡雞胚，標(biāo)記氣室和胚胎位置，垂直放置在卵架上，鈍端27卵黃囊接種法卵黃囊接種法28解剖與收獲收獲時(shí)，雞卵預(yù)冷，消毒氣室端的卵殼，剪掉卵殼，除去殼膜后，用鑷子將卵黃囊與絨毛尿囊膜分開(kāi)。夾出卵黃囊放在滅菌平皿中，必要時(shí)用生理鹽水沖去卵黃。也可將全部?jī)?nèi)容物傾入平皿中，然后剝出卵黃囊。將不帶卵黃的膜放在無(wú)菌平皿或燒杯中，以便用于染色檢查或進(jìn)行傳代。對(duì)某些病毒的分離則要收集全部胚體。解剖與收獲29雞胚接種技術(shù)分析課件30三、注意事項(xiàng)防止污染：雞胚為一活的有機(jī)體，因此要嚴(yán)格無(wú)菌操作。動(dòng)作要仔細(xì)，以免造成物理死亡。接種后24小時(shí)內(nèi)死亡應(yīng)不計(jì)結(jié)果。適宜的培養(yǎng)溫度：三、注意事項(xiàng)防止污染：雞胚為一活的有機(jī)體，因此31第四節(jié)病毒的檢測(cè)無(wú)菌試驗(yàn)—目的:證實(shí)收集的雞胚是否受到細(xì)菌的污染。—方法:收集雞胚組織接種肉湯培養(yǎng)；37℃培養(yǎng)36h；肉湯清亮則無(wú)污染,肉湯渾濁或有菌落,說(shuō)明雞胚被細(xì)菌污染。第四節(jié)病毒的檢測(cè)無(wú)菌試驗(yàn)32直接觀察法—在絨毛尿囊腔形成損害或皰疹:如痘類(lèi)病毒和皰疹病毒,常產(chǎn)生白色或灰色痘皰,并有充血；—引起雞胚死亡:如新城疫病毒、乙腦病毒；—造成雞胚損害和胚胎生長(zhǎng)遲緩：馬流感病毒。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法—血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)：流感病毒的存在；—補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：腮腺炎病毒；—其他方法：PCR等。檢測(cè)方法直接觀察法檢測(cè)方法33第五節(jié)雞胚接種技術(shù)的應(yīng)用病毒的培養(yǎng)、分離與鑒定流感病毒的分離和鑒定禽流感病毒的分離和鑒定其他病毒的分離和鑒定疫苗的研制活疫苗和死疫苗第五節(jié)雞胚接種技術(shù)的應(yīng)用病毒的培養(yǎng)、分離與鑒定34第三章動(dòng)物試驗(yàn)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(experimentalanimals)：是指經(jīng)人工飼養(yǎng)，遺傳背景明確、來(lái)源清楚，控制其攜帶的微生物，用于科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)、鑒定以及其它科學(xué)實(shí)驗(yàn)的所有動(dòng)物。第三章動(dòng)物試驗(yàn)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(experimen35第一節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類(lèi)和基本

操作方法第一節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類(lèi)和基本

操作方法36一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類(lèi)

（微生物控制分類(lèi)）普通動(dòng)物(conventionalanimals，CV)：稱(chēng)一級(jí)動(dòng)物，是微生物控制要求最低級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，要求不攜帶動(dòng)物烈性傳染病和人獸共患病病原。一般僅供教學(xué)示范及作為預(yù)備試驗(yàn)之用。清潔動(dòng)物(cleananimals，CL)：稱(chēng)二級(jí)動(dòng)物，除不攜帶普通動(dòng)物病原體外，要求不攜帶對(duì)動(dòng)物危害大、對(duì)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原體。無(wú)特定病原體動(dòng)物(specificpathogenfreeanimals，SPF)：又稱(chēng)三級(jí)動(dòng)物，除普通動(dòng)物、清潔動(dòng)物不得攜帶的病原外，還要求排除潛在感染或條件致病菌的感染。是目前國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，適合于作所有科研實(shí)驗(yàn)。無(wú)菌動(dòng)物(germfreeanimals，GF)和悉生動(dòng)物(gnotobioticanimals，GN)：為四級(jí)動(dòng)物。無(wú)菌動(dòng)物要求在體內(nèi)外不得檢出其他的生命體。悉生動(dòng)物又稱(chēng)已知菌動(dòng)物，是將已知菌植入無(wú)菌動(dòng)物體內(nèi)。一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類(lèi)

（微生物控制分類(lèi)）普通動(dòng)物(conven37實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳學(xué)控制分類(lèi)

近交系(inbredstrain)：是指經(jīng)過(guò)連續(xù)20代以上全同胞或親子交配培育的動(dòng)物品系。特點(diǎn)有:基因型相同，表現(xiàn)型一致；對(duì)外來(lái)刺激反應(yīng)一致；實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，可比性強(qiáng)。封閉群(closedcolony)：是指一個(gè)不從外界引入新的血緣，非近親交配方式繁殖一定代次的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群體。特點(diǎn)是群體遺傳特異性相對(duì)穩(wěn)定，個(gè)體間具有雜合性，存在一定差異。突變系(mutantstrain)：是指由于遺傳基因發(fā)生突變而具有某些特殊性狀的動(dòng)物，如肥胖癥小鼠、糖尿病小鼠等。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳學(xué)控制分類(lèi)近交系(inbredstrain38實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳學(xué)控制分類(lèi)

雜交群動(dòng)物(hybridanimal)：又稱(chēng)異系雜交，是由不同的品系雜交所產(chǎn)生的后代。由兩個(gè)近交系之間交配產(chǎn)生的動(dòng)物稱(chēng)為雜交一代，其遺傳和表型均一性好，生命力、適應(yīng)力和抗病力較近交系動(dòng)物強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)范圍更大。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimals)與基因缺陷動(dòng)物：將外源性基因插入生殖細(xì)胞基因組并能正常繁衍的動(dòng)物稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。另外，還可以采用基因剔除技術(shù)構(gòu)建基因缺陷動(dòng)物，通過(guò)刪減單一基因或相關(guān)基因組，研究基因的功能。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳學(xué)控制分類(lèi)雜交群動(dòng)物(hybridanim39二、常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠：昆明小鼠、BALB/c小鼠、裸鼠、SCID小鼠；豚鼠：制備抗體和補(bǔ)體以及提供紅細(xì)胞。家兔：二、常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠：昆明小鼠、BALB/c小鼠、裸鼠、40三、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用基本操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的捕捉和固定：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)和分組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的麻醉方法：乙醚吸入法是最常用的方法。三、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用基本操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的捕捉和固定：41皮下接種：多用于觀察動(dòng)物病毒感染后的免疫學(xué)指標(biāo)。腹腔接種：大小鼠接種多用此方法?？捎糜诓《靖腥炯案腥竞竺庖咧刚鞯挠^察，或作為抗病毒的給藥途徑。靜脈接種：可造成病毒全身性感染，可觀察病毒的致病性或機(jī)體對(duì)病毒的清除機(jī)制。小鼠、大鼠采用尾靜脈注射。豚鼠采用前肢皮下靜脈注射。兔采用外耳緣靜脈注射。接種途徑和接種方法皮下接種：多用于觀察動(dòng)物病毒感染后的免疫學(xué)指標(biāo)。接種途徑和接42消化道接種：用于分離腹瀉病毒或由消化道感染病毒研究。鼻腔接種法：將接種物滴入動(dòng)物鼻腔，接種量小鼠0.03～0.05ml，大鼠0.05～O.1ml。顱內(nèi)接種法：將臨床標(biāo)本或特定的病毒直接接種于動(dòng)物腦內(nèi)，使動(dòng)物形成實(shí)驗(yàn)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。角膜接種法:細(xì)針尖輕劃角膜，劃痕與眼裂平行，約三道。接種液滴加2～3滴，接種后48～72h觀察結(jié)果。消化道接種：用于分離腹瀉病毒或由消化道感染病43實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集采血方法腦脊液的采集尿液的采集腹水的采集實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集采血方法44四、使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本原則研究目的明確：

—探討疾病的發(fā)病機(jī)制和復(fù)制動(dòng)物模型；

—制備診斷抗原、抗體及疫苗；

—監(jiān)測(cè)診斷抗原、抗體及疫苗的安全性、有效性。動(dòng)物選擇原則：使用順序：小鼠、大鼠、兔、犬、猴、人。使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3Rs原則：replace(替代）、reduction(減少）、refinement(優(yōu)化）的原則。四、使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基本原則研究目的明確：45第二節(jié)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在病毒檢驗(yàn)中的應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在病毒分離中的應(yīng)用

—確定疾病的病因；

—使病毒增殖，提高臨床檢出率；

—制備高滴度的病毒診斷抗原；

—制備大量的抗病毒血清。第二節(jié)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在病毒檢驗(yàn)中的應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在病毒分離中的應(yīng)46動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在病毒鑒定中的應(yīng)用

—病毒的宿主范圍；

—病毒對(duì)組織的親嗜性；

—病毒的感染性和侵襲強(qiáng)度；

—病毒可能的傳播途徑，以及與臨床相關(guān)的體征和癥狀；—病毒誘導(dǎo)宿主的免疫反應(yīng)特征。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在病毒鑒定中的應(yīng)用47動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在病毒性疾病研究中的應(yīng)用

—

病毒與宿主之間相互作用的機(jī)制；

—病毒慢性感染和潛伏感染機(jī)制；

—病毒感染的免疫逃逸和免疫耐受機(jī)制；

—病毒誘發(fā)腫瘤的機(jī)制；—病毒特殊基因或蛋白在病毒感染中的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在病毒性疾病研究中的應(yīng)用48動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在抗病毒藥物和疫苗效果及安全性檢測(cè)中的應(yīng)用

—評(píng)價(jià)抗病毒藥物的療效和安全性；

—評(píng)價(jià)免疫血清的安全性和效果；

—評(píng)價(jià)疫苗的安全性和效果；

—評(píng)價(jià)佐劑的安全性和效果。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在抗病毒藥物和疫苗效果及安全性檢測(cè)中的應(yīng)用49第三節(jié)病毒學(xué)檢驗(yàn)中動(dòng)物實(shí)

驗(yàn)的基本步驟臨床標(biāo)本的制備和處理；敏感動(dòng)物的選擇、標(biāo)記并分組；接種途徑的選擇；觀察病毒感染動(dòng)物的異常生理變化；動(dòng)物標(biāo)本的采集、處理和檢查；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析。第三節(jié)病毒學(xué)檢驗(yàn)中動(dòng)物實(shí)

50第四節(jié)病毒學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)

注意的問(wèn)題安全問(wèn)題：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自發(fā)性病毒感染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。第四節(jié)病毒學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)

51小結(jié)雞胚接種的優(yōu)缺點(diǎn)；四種常見(jiàn)的雞胚接種途徑及注意事項(xiàng)；雞胚接種后病毒的檢測(cè)；雞胚接種技術(shù)的應(yīng)用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在病毒檢驗(yàn)中的應(yīng)用及注意的問(wèn)題。小結(jié)雞胚接種的優(yōu)缺點(diǎn)；52THEENDTHEEND53第二章雞胚接種技術(shù)第二章雞胚接種技術(shù)54一、概況1911年Rous和Murphy首先應(yīng)用雞胚培養(yǎng)研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。1938年Goodpasture和Burnet等應(yīng)用雞胚繁殖病毒、Cox應(yīng)用卵黃囊培養(yǎng)立克次體。一、概況1911年Rous和Murphy首先應(yīng)用雞胚培養(yǎng)研究55

雞胚培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)：雞胚的組織分化程度低，可選擇適當(dāng)途徑接種，病毒易復(fù)制，感染病毒的膜和液體含大量病毒。雞胚是一整體，有神經(jīng)血管的分布及臟器的構(gòu)造。來(lái)源充足，操作簡(jiǎn)單，通常是無(wú)菌的，對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體。雞胚接種技術(shù)分析課件56

雞胚培養(yǎng)法的缺點(diǎn)：一般的病毒通常不使雞胚產(chǎn)生特異性的感染指征。卵黃中常常含有抗家禽病原體的母體抗體。某些細(xì)菌、衣原體和病毒能夠從感染的母雞傳遞到雞胚。通常雞胚含有白血病病毒。在雞食物中加入抗菌素，母雞吃后會(huì)傳遞給雞胚，雞胚就會(huì)產(chǎn)生對(duì)立克次體和衣原體感染的抵抗。雞胚培養(yǎng)法的缺點(diǎn)：57

第一節(jié)雞胚的結(jié)構(gòu)與生理

雞胚是由三個(gè)胚層發(fā)育起來(lái)的，即外胚層、中胚層和內(nèi)胚層，它們構(gòu)成胚胎的組織與器官。（約10日齡雞胚的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖）

第一節(jié)雞胚的結(jié)構(gòu)與生理

雞胚是由三個(gè)胚層發(fā)育起來(lái)的58雞胚接種技術(shù)分析課件59卵殼與殼膜卵殼位于最外層的堅(jiān)硬殼層；殼膜位于卵殼的下層，允許氣體和液體分子交換，因此培養(yǎng)雞胚需一定的濕度和氣體。氣室功能主要是呼吸和調(diào)節(jié)壓力。絨毛尿囊膜殼膜之下，主要是胚胎的呼吸器官。羊膜胚胎的最內(nèi)層包被，含羊水，胚胎在其中。卵殼與殼膜60尿囊腔位于絨毛尿囊腔和羊膜之間，胚胎排泄器官含5－20ml尿囊液，含大量的尿酸鹽，為減少沉淀，鹽水稀釋再4℃保存。卵黃囊主要營(yíng)養(yǎng)的儲(chǔ)藏場(chǎng)所，為胚胎提供營(yíng)養(yǎng)。卵白外于卵的銳端，為胚胎發(fā)育晚期提供營(yíng)養(yǎng)。尿囊腔61第二節(jié)雞胚的孵育和檢查受精雞卵的供給—沒(méi)有受到病毒和細(xì)菌的污染如新城雞瘟病毒、布氏桿菌等；—培養(yǎng)立克次體和衣原體，不能來(lái)自食用抗生素的雞群。第二節(jié)雞胚的孵育和檢查受精雞卵的供給62雞胚的孵育—溫度為38～39℃；—濕度為40％-70％；—翻蛋：防止蛋白粘連，促進(jìn)羊膜運(yùn)動(dòng)和空氣流通；—通風(fēng)：排出CO2和吸入O2。雞胚的孵育63

檢卵

—血管：活胚可見(jiàn)清晰的血管，有時(shí)可見(jiàn)血管搏動(dòng)，死胚血管模糊成淤血帶或淤血塊。

—胎動(dòng)：活胚可見(jiàn)明顯的自然運(yùn)動(dòng)，尤其在轉(zhuǎn)動(dòng)胚胎時(shí)，死胚見(jiàn)不到任何胎動(dòng)，胚胎發(fā)紅像出血樣，有的呈現(xiàn)黑塊。

—絨毛尿囊膜發(fā)育界限：發(fā)育好的雞胚可見(jiàn)密布豐滿(mǎn)的血管網(wǎng)，也就是絨毛尿囊膜，死胚則見(jiàn)不到這一現(xiàn)象。檢卵64雞胚接種技術(shù)分析課件65第三節(jié)雞胚接種途徑及方法（一）羊膜腔接種

應(yīng)用于從臨床材料中分離流感病毒等，病毒感染后可收集羊水和尿囊液。第三節(jié)雞胚接種途徑及方法（一）羊膜腔接種66接種步驟與方法將10~12日齡的雞胚在檢卵燈上照視，標(biāo)記氣室及胚胎的位置。消毒氣室部位的蛋殼，在氣室頂端鉆出一約10mm×6mm的長(zhǎng)方形裂痕，注意勿鉆破殼膜。再次消毒鉆孔區(qū)后，用滅菌的小鑷子除去長(zhǎng)方形卵殼和外層殼膜，并滴加滅菌液體石蠟一滴于下層殼膜上，使其透明，以便觀察胚胎的位置。將注射器刺向胚胎的腭下胸前，以針頭撥動(dòng)下顎及腿，當(dāng)進(jìn)入羊膜腔內(nèi)時(shí)，可看到雞胚隨針頭的撥動(dòng)而動(dòng)，此時(shí)可注入O.1～0.2ml病毒液。拔出針頭，孔區(qū)消毒后用沾有碘酒通過(guò)火焰的小塊膠布將卵殼的窗口封住，于33～35℃孵育48～72h，要保持雞胚鈍端朝上。接種步驟與方法67羊膜腔接種法

羊膜腔接種法68雞胚接種技術(shù)分析課件69解剖與收獲收獲前雞胚須置4℃冰箱6h或過(guò)夜，但不能放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起散黃)。如急于收獲亦可置-20℃冰箱lh左右。預(yù)冷的目的是，將雞胚凍死，使血液凝固，避免收獲時(shí)流出紅細(xì)胞，并同尿囊液的病毒發(fā)生凝集，造成病毒滴度下降。病毒通過(guò)胚胎機(jī)體后被排泄入尿囊腔，因此當(dāng)羊水過(guò)少時(shí)，可用同胚少量尿囊液沖洗羊膜腔并吸取該洗液。解剖與收獲70（二）絨毛尿囊膜接種常用于牛痘病毒、天花病毒、單純皰疹病毒的分離，因?yàn)檫@些病毒在絨毛尿囊膜上可形成肉眼可見(jiàn)的斑點(diǎn)狀或痘皰狀病灶。另外，病毒可在絨毛尿囊膜上進(jìn)行滴定，因?yàn)楦腥拘圆《绢w粒的數(shù)目可以通過(guò)產(chǎn)生的斑和痘的數(shù)目來(lái)計(jì)算。該方法還可用于抗病毒血清的滴定試驗(yàn)，即在有抗體存在的情況下，痘皰形成受到抑制。（二）絨毛尿囊膜接種71將孵育l0~13日齡的雞胚標(biāo)記氣室、胎位，于與胚胎略近氣室端卵殼上劃一等邊三角形。消毒氣室頂端及記號(hào)處，用開(kāi)孔器在記號(hào)處的卵殼上開(kāi)一三角形裂痕，不可弄破下面的殼膜，同時(shí)在氣室頂端鉆一小孔。輕輕揭去卵殼，露出殼膜，在殼膜上滴一滴生理鹽水，用針尖循卵殼膜纖維方向劃破一隙，勿傷及緊貼的絨毛尿囊膜。用針尖刺破氣室小孔處的殼膜，再用橡皮乳頭緊按氣室小孔向外吸氣，此時(shí)鹽水小滴即可自裂隙流至絨毛尿囊膜上，從而使絨毛尿囊膜下陷而形成人工氣室。在卵殼的窗口滴0.05~0.1ml病毒液于絨毛尿囊膜上，然后將旋轉(zhuǎn)雞胚使接種物擴(kuò)散到整個(gè)絨毛膜尿囊膜上。在卵殼的窗口周?chē)渴?，用消毒膠布封口。將雞胚保持人工氣室在上的位置，33~35℃繼續(xù)培養(yǎng)48～72h。接種步驟與方法將孵育l0~13日齡的雞胚標(biāo)記氣室、胎位，于與胚胎略近氣室端72絨毛尿囊膜接種法絨毛尿囊膜接種法73解剖與收獲用剪刀沿人工氣室邊緣將膜剪下，放入加有滅菌生理鹽水的培養(yǎng)皿內(nèi)，觀察病灶形狀或用于傳代，或用50％甘油保存。同時(shí)作無(wú)菌培養(yǎng)。

解剖與收獲74（三）尿囊腔接種廣泛應(yīng)用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的適應(yīng)和傳代培養(yǎng)，這些病毒被接種到尿囊腔后，可在內(nèi)皮細(xì)胞中復(fù)制，復(fù)制的病毒被釋放到尿囊液中，因此，在尿囊液中含有大量的病毒。（三）尿囊腔接種75取9~11日齡的雞胚，標(biāo)記氣室與胚胎位置，并在胚胎面與氣室交界之邊緣上約1mm處避開(kāi)血管作一標(biāo)記，此即為注射點(diǎn)。將雞胚豎放在卵杯上，鈍端向上。消毒氣室的蛋殼，用開(kāi)孔器鉆開(kāi)一長(zhǎng)約2mm小口。再次消毒鉆孔區(qū)，接種病毒液0.1～0.2ml，將針頭刺入孔內(nèi)，經(jīng)尿囊膜入尿囊腔，注入病毒液。消毒后用石蠟溶化封孔，于33～35℃孵卵器孵育48～72h，；于接種后24h內(nèi)死亡者為非特異性死胚應(yīng)棄去。接種步驟與方法取9~11日齡的雞胚，標(biāo)記氣室與胚胎位置，并在胚胎面與氣室交76尿囊腔接種法尿囊腔接種法77解剖與收獲接種后收獲病毒的時(shí)間根據(jù)不同病毒而異，甲型流感病毒一般培養(yǎng)44～48h，乙型流感病毒培養(yǎng)72h。收獲前雞胚置4℃冰箱6h或過(guò)夜，但不能放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。消毒氣室的卵殼，用滅菌剪刀剪去氣室部的卵殼，用無(wú)菌鑷子撕去氣室部殼膜，并翻開(kāi)到卵殼邊上。將雞卵傾向胚胎一側(cè)，用滅菌毛細(xì)吸管通過(guò)絨毛尿囊膜進(jìn)入尿囊腔，吸出尿囊液。一般一個(gè)雞胚可收獲5～10ml的尿囊液。若操作時(shí)損傷了血管，則病毒會(huì)吸附在紅細(xì)胞上，尿囊液則無(wú)。經(jīng)無(wú)菌試驗(yàn)后，可在4℃或低溫保存。解剖與收獲78（四）卵黃囊接種主要用于蟲(chóng)媒病毒、衣原體及立克次體等的分離和繁殖。這些大的病原體主要在卵黃囊的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)速度很快，立克次體染色后也可看到。（四）卵黃囊接種79取5～8日齡雞胚，標(biāo)記氣室和胚胎位置，垂直放置在卵架上，鈍端朝上，消毒氣室端。用開(kāi)孔器在氣室中央的卵殼上鉆一小孔，用帶有6號(hào)針頭的1m1注射器將樣品從小孔處沿胚的縱軸迅速刺入約3cm，注入0.2～0.5ml待接種的病毒于卵黃囊內(nèi)，隨后用膠帶或溶化的石蠟封孔。置孵化箱內(nèi)繼續(xù)孵育3～8d，時(shí)間長(zhǎng)短應(yīng)根據(jù)病毒或立克次體的種類(lèi)而定，每天翻卵2次，棄掉24h內(nèi)死亡的雞胚(但東方型和西方型馬腦炎可能在接種后15～24h內(nèi)死亡)。接種步驟與方法取5～8日齡雞胚，標(biāo)記氣室和胚胎位置，垂直放置在卵架上，鈍端80卵黃囊接種法卵黃囊接種法81解剖與收獲收獲時(shí)，雞卵預(yù)冷，消毒氣室端的卵殼，剪掉卵殼，除去殼膜后，用鑷子將卵黃囊與絨毛尿囊膜分開(kāi)。夾出卵黃囊放在滅菌平皿中，必要時(shí)用生理鹽水沖去卵黃。也可將全部?jī)?nèi)容物傾入平皿中，然后剝出卵黃囊。將不帶卵黃的膜放在無(wú)菌平皿或燒杯中，以便用于染色檢查或進(jìn)行傳代。對(duì)某些病毒的分離則要收集全部胚體。解剖與收獲82雞胚接種技術(shù)分析課件83三、注意事項(xiàng)防止污染：雞胚為一活的有機(jī)體，因此要嚴(yán)格無(wú)菌操作。動(dòng)作要仔細(xì)，以免造成物理死亡。接種后24小時(shí)內(nèi)死亡應(yīng)不計(jì)結(jié)果。適宜的培養(yǎng)溫度：三、注意事項(xiàng)防止污染：雞胚為一活的有機(jī)體，因此84第四節(jié)病毒的檢測(cè)無(wú)菌試驗(yàn)—目的:證實(shí)收集的雞胚是否受到細(xì)菌的污染?！椒?收集雞胚組織接種肉湯培養(yǎng)；37℃培養(yǎng)36h；肉湯清亮則無(wú)污染,肉湯渾濁或有菌落,說(shuō)明雞胚被細(xì)菌污染。第四節(jié)病毒的檢測(cè)無(wú)菌試驗(yàn)85直接觀察法—在絨毛尿囊腔形成損害或皰疹:如痘類(lèi)病毒和皰疹病毒,常產(chǎn)生白色或灰色痘皰,并有充血；—引起雞胚死亡:如新城疫病毒、乙腦病毒；—造成雞胚損害和胚胎生長(zhǎng)遲緩：馬流感病毒。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法—血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)：流感病毒的存在；—補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：腮腺炎病毒；—其他方法：PCR等。檢測(cè)方法直接觀察法檢測(cè)方法86第五節(jié)雞胚接種技術(shù)的應(yīng)用病毒的培養(yǎng)、分離與鑒定流感病毒的分離和鑒定禽流感病毒的分離和鑒定其他病毒的分離和鑒定疫苗的研制活疫苗和死疫苗第五節(jié)雞胚接種技術(shù)的應(yīng)用病毒的培養(yǎng)、分離與鑒定87第三章動(dòng)物試驗(yàn)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(experimentalanimals)：是指經(jīng)人工飼養(yǎng)，遺傳背景明確、來(lái)源清楚，控制其攜帶的微生物，用于科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)、鑒定以及其它科學(xué)實(shí)驗(yàn)的所有動(dòng)物。第三章動(dòng)物試驗(yàn)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(experimen88第一節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類(lèi)和基本

操作方法第一節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類(lèi)和基本

操作方法89一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類(lèi)

（微生物控制分類(lèi)）普通動(dòng)物(conventionalanimals，CV)：稱(chēng)一級(jí)動(dòng)物，是微生物控制要求最低級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，要求不攜帶動(dòng)物烈性傳染病和人獸共患病病原。一般僅供教學(xué)示范及作為預(yù)備試驗(yàn)之用。清潔動(dòng)物(cleananimals，CL)：稱(chēng)二級(jí)動(dòng)物，除不攜帶普通動(dòng)物病原體外，要求不攜帶對(duì)動(dòng)物危害大、對(duì)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原體。無(wú)特定病原體動(dòng)物(specificpathogenfreeanimals，SPF)：又稱(chēng)三級(jí)動(dòng)物，除普通動(dòng)物、清潔動(dòng)物不得攜帶的病原外，還要求排除潛在感染或條件致病菌的感染。是目前國(guó)際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，適合于作所有科研實(shí)驗(yàn)。無(wú)菌動(dòng)物(germfreeanimals，GF)和悉生動(dòng)物(gnotobioticanimals，GN)：為四級(jí)動(dòng)物。無(wú)菌動(dòng)物要求在體內(nèi)外不得檢出其他的生命體。悉生動(dòng)物又稱(chēng)已知菌動(dòng)物，是將已知菌植入無(wú)菌動(dòng)物體內(nèi)。一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類(lèi)

（微生物控制分類(lèi)）普通動(dòng)物(conven90實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳學(xué)控制分類(lèi)

近交系(inbredstrain)：是指經(jīng)過(guò)連續(xù)20代以上全同胞或親子交配培育的動(dòng)物品系。特點(diǎn)有:基因型相同，表現(xiàn)型一致；對(duì)外來(lái)刺激反應(yīng)一致；實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，可比性強(qiáng)。封閉群(closedcolony)：是指一個(gè)不從外界引入新的血緣，非近親交配方式繁殖一定代次的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群體。特點(diǎn)是群體遺傳特異性相對(duì)穩(wěn)定，個(gè)體間具有雜合性，存在一定差異。突變系(mutantstrain)：是指由于遺傳基因發(fā)生突變而具有某些特殊性狀的動(dòng)物，如肥胖癥小鼠、糖尿病小鼠等。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳學(xué)控制分類(lèi)近交系(inbredstrain91實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳學(xué)控制分類(lèi)

雜交群動(dòng)物(hybridanimal)：又稱(chēng)異系雜交，是由不同的品系雜交所產(chǎn)生的后代。由兩個(gè)近交系之間交配產(chǎn)生的動(dòng)物稱(chēng)為雜交一代，其遺傳和表型均一性好，生命力、適應(yīng)力和抗病力較近交系動(dòng)物強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)范圍更大。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenicanimals)與基因缺陷動(dòng)物：將外源性基因插入生殖細(xì)胞基因組并能正常繁衍的動(dòng)物稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。另外，還可以采用基因剔除技術(shù)構(gòu)建基因缺陷動(dòng)物，通過(guò)刪減單一基因或相關(guān)基因組，研究基因的功能。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳學(xué)控制分類(lèi)雜交群動(dòng)物(hybridanim92二、常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠：昆明小鼠、BALB/c小鼠、裸鼠、SCID小鼠；豚鼠：制備抗體和補(bǔ)體以及提供紅細(xì)胞。家兔：二、常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠：昆明小鼠、BALB/c小鼠、裸鼠、93三、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用基本操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的捕捉和固定：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)和分組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的麻醉方法：乙醚吸入法是最常用的方法。三、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用基本操作技術(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的捕捉和固定：94皮下接種：多用于觀察動(dòng)物病毒感染后的免疫學(xué)指標(biāo)。腹腔接種：大小鼠接種多用此方法?？捎糜诓《靖腥炯案腥竞竺庖咧刚鞯挠^察，或作為抗病毒的給藥途徑。靜脈接種：可造成病毒全身性感染，可觀察病毒的致病性或機(jī)體對(duì)病毒的清除機(jī)制。小鼠、大鼠采用尾靜脈注射。豚鼠采用前肢皮下靜脈注射。兔采用外耳緣靜脈注射。接種途徑和接種方法皮下接種：多用于觀察動(dòng)物病毒感染后的免疫學(xué)指標(biāo)。接種途徑和接95消化道接種：用于分離腹瀉病毒或由消化道感染病毒研究。