精品精品可編輯可編輯呋喃妥因代謝物（AHD）ELISA檢測試劑盒說明書一、概要用來檢測呋喃妥因代謝物的最常用方法是和LC-MS/MSAHD二、試驗原理本試劑盒采用間接競爭ELISAAHDTMBAHD準曲線比較即可得出樣本中呋喃妥因代謝物的殘留量。三、適用范圍可定性、定量檢測動物組織（留量。四、交叉反應率呋喃妥因代謝物… 100%呋喃唑酮代謝物… 小于0.1%呋喃它酮代謝物… 小于0.1%硝基糠腙（呋喃西林）代謝物… 小于0.1%呋喃唑酮… 小于1%………………小于1%呋喃妥因… 13%呋喃西林… 小于1%五、使用單位需自備的設備及試劑設備：┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm┅┅旋轉蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置┅┅均質器┅┅振蕩器┅┅渦旋儀┅┅離心機┅┅天平：感量0.01g┅┅刻度移液管：10ml┅┅洗耳球┅┅容量瓶：100ml、1L┅┅玻璃試管：10ml┅┅聚苯乙烯離心管：50ml┅┅微量移液器：單道20ml～200ml、100ml～1000ml多道250ml試劑：┅┅乙酸乙酯(分析純)┅┅正己烷（或正庚烷）(分析純)┅┅三水合磷酸氫二鉀(分析純)┅┅甲醇(分析純)┅┅二水合亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O（分析純（供奶樣用）┅┅七水合硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)(分析純)（供奶樣用）┅┅濃鹽酸┅┅氫氧化鈉(分析純)┅┅去離子水六、提供的材料與試劑1、96孔酶標板×1塊（包被有偶聯(lián)抗原）2、標準液×61ml瓶）31ml瓶）100ppb4、酶標二抗 12ml 紅色帽5、抗體工作液 7ml 綠色帽6、底物液A液 7ml 白色帽7、底物液B液 7ml 紅色帽8、終止液 7ml 黃色帽9、20×濃縮洗滌液 40ml… 透明帽10、2×濃縮復溶液 50ml 藍色帽11、2-硝基苯甲醛 15.1mg… 黑色帽七、溶液的配制配液1:衍生化試劑向裝有2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加甲醇溶解定容至10m（濃度為10mM配液2:C液（供奶樣用：0.36M亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）溶液12.5g二水合亞硝基鐵氰化鈉加去離子水定容至D液（供奶樣專用：1M硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）溶液稱取29.8g硫酸鋅用去離子水定容至100ml配液3:0.1M磷酸氫二鉀溶液22.8g三水合磷酸氫二鉀加去離子水定容至1L4:1M8.3ml100ml5:1M稱取4.0g氫氧化鈉加去離子水定容至100ml。配液6:甲醇-水溶液90ml10ml7:復溶工作液2×1：12×+1用于提取樣本的復溶，復溶工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。配液8:洗滌工作液用去離子水將2020×+19）4℃環(huán)境可保存一個月。八、樣本前處理步驟樣本處理前須知處理任何樣本時，都必須注意：（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。實驗結果2-8℃保存半年。未處理的樣本冷凍保存。2-8℃24（一）肌肉、肝臟、水產（魚蝦等）組織前處理方法┅┅用均質器均質樣本┅┅取1.0±0.05g的均質物至50ml聚苯乙烯離心管中；┅┅加入5ml（見配液，用振蕩器振蕩5mi，3000g以上離心10mi（本步驟可降低樣本基質干擾）4ml0.5ml1M（衍生化試劑（見配液1，用振蕩器充分振蕩；┅┅接（四）描述方法（*處。注：樣本應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存（二）牛奶前處理方法┅┅取牛奶樣本，3000g以上，10℃離心10min，吸除上層脂肪；┅┅取出5ml去除脂肪牛奶樣本至10ml玻璃離心管中；┅┅分別加入250mlC液和250mlD液（見配液；4~12oC（39-54℉）10min離心機，則先將樣本降溫至大約8o（46℉，然后離心；┅┅取牛奶的離心上清液1.1m（相當于1ml奶樣，分別加入4ml的去離子水用振蕩器0.5ml1M鹽酸（見配液）和100ml衍生化試劑（見配液，充分振蕩┅┅接（四）描述方法（*處。（三）蜂蜜前處理方法┅┅稱取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中；┅┅加入4ml的去離子水，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；┅┅0.5ml1M鹽酸溶液（見配液4和100ml（見配液┅┅接（四）描述方法（*處。（四）接上面的方法*┅┅在37oC過夜孵育（大約16；┅┅分別加入5ml0.1M磷酸氫二鉀溶液（見配液、0.4ml1M氫氧化鈉溶液（見配液5ml30s；┅┅3000g以上，室溫（20-25oC/68-77℉）離心10min；┅┅取2.5ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃試管中，于50～60℃氮氣流下吹干；┅┅用1ml的正己烷（或正庚烷）用渦旋儀渦動30，再加入1ml復溶工作液（見配液1min┅┅3000g以上，室溫（20-25oC/68-77℉）離心10min；┅┅除去上層有機相，取下層水相50μl用于分析。九、檢測步驟1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫2025℃。2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。操作步驟：1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。5、加標準品/樣本：加入標準品/樣本50ml到對應的微孔中，然后加入抗體工作液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應30min。6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液（見配液8）250ml/孔，充分洗滌4－510s，用吸水紙拍干（戳破。7、加酶標二抗：加入酶標二抗100ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應30min，取出重復洗板步驟6。8、顯色：加入底物液A50ml/孔，再加底物液B50ml/板后置37℃避光環(huán)境中反應15mi（見注意事項8。9、測定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數(shù)據(jù)，測定每孔OD十、結果判定12與呋喃妥因代謝物的含量成負相關。1(ppb1的吸光度值0.23620.666，標準品吸光度值分別是：0ppb1.949；0.1ppb1.4340.3ppb.9390.9ppb0.4872.7ppb0.1578.1ppb0.060。則樣本1的濃度范圍是0.9ppb-2.7ppb20.3ppb-0.9ppb2、定量分析平均值（雙孔）除以第一個標準）100%，即百分吸光度值BB0B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0—0ppb標準溶液的平均吸光度值標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標，以呋喃妥因代謝物標準品濃度的半對數(shù)為橫坐標，度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃妥因代謝物的實際濃度。（歡迎來電索取樣本稀釋倍數(shù)十一、檢測方法靈敏度、準確度、精密度試劑盒靈敏度：0.1ppb樣本最低檢測限：組織、蜂蜜，牛奶樣品檢測下限… 0.2ppb蝦\魚等水產組織因存在一定的干擾，檢測下限在0.3ppb準確度：水產、肌肉、肝臟組織 75±15%蜂蜜樣本 90±15%奶樣………………精密度：試劑盒的變異系數(shù)均小于10%十二、注意事項1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。3、每加一種試劑前需要將其搖勻。4、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。6、儲存條件保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、試劑變質的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質，應當棄之。0標準的吸光度（450/630n