毛細(xì)管凝膠電泳

(capillarygelelectrophoresis)Contents1發(fā)展簡史2毛細(xì)管凝膠電泳的原理3毛細(xì)管凝膠柱的制備技術(shù)4現(xiàn)有交聯(lián)凝膠柱制備技術(shù)5凝膠缺陷的形成原因和避免措施6毛細(xì)管凝膠電泳的應(yīng)用7CGE技術(shù)的問題與展望8相關(guān)文獻(xiàn)一、發(fā)展簡介1.早在六十年代,Hjerten就嘗試過毛細(xì)管電泳技術(shù),在七十年代Virtanen和Mikkers等人也進(jìn)行過研究。由于受到檢測器靈敏度的限制,不能用細(xì)內(nèi)徑的毛細(xì)管,電泳過程中產(chǎn)生的焦耳熱不能很好地散失,以致限制了高電壓的運(yùn)用,嚴(yán)重影響了分離效率。2.七十年代末,毛細(xì)管技術(shù)的廣泛應(yīng)用,使得人們加快了對(duì)細(xì)管電泳的研究。1951年,Jorgensen等人改善了檢測器的靈敏度,可以使用75um內(nèi)徑的玻璃毛細(xì)管,并采用了30kV的高壓,獲得了很高的效率(N=4x105s)。他們對(duì)毛細(xì)管電泳分離理論的研究以及柱效方程的推導(dǎo),對(duì)毛細(xì)管電泳技術(shù)的發(fā)展起了巨大的推動(dòng)作用。3.1983年hierten首次將傳統(tǒng)凝膠電泳技術(shù)中的聚丙烯酞凝膠裝入150um的玻璃毛細(xì)管,以消除毛細(xì)管內(nèi)壁對(duì)蛋白質(zhì)的吸附,并利用這種方法對(duì)多種蛋白質(zhì)進(jìn)行了分離,取得了很好的分離效果。1957年,oChen和Karger使用了100um內(nèi)徑以下的彈性石英毛細(xì)管,用同管內(nèi)壁交聯(lián)的方法制備凝膠柱,分離了蛋白質(zhì)、DNA和寡聚核昔酸。4.1990年,Lux和Yin等人對(duì)oChen和Karger柱制備技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn),提出了用線性聚丙烯酞胺對(duì)柱內(nèi)表面預(yù)處理和用γ射線引發(fā)聚合的方法,在分離DNA內(nèi)切片段和寡聚核昔酸時(shí)取得極好的效率。二、基本原理毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)是毛細(xì)管電泳的幾種操作模式之一,特別適于分離蛋白質(zhì)、核酸片段等生物大分子,具有分離能力強(qiáng)、速度快等特點(diǎn)。毛細(xì)管凝膠電泳,是將板上的凝膠移到毛細(xì)管中作支持物進(jìn)行的電泳。凝膠具有多孔性,起類似分子篩的作用,溶質(zhì)按分子大小逐一分離。凝膠粘度大,能減少溶質(zhì)的擴(kuò)散,所得峰形尖銳,能達(dá)到最高的柱效。常用聚丙烯酞胺在毛細(xì)管內(nèi)交聯(lián)制成凝膠柱,可分離測定蛋白質(zhì)和的分子量或堿基數(shù),但其制備麻煩,使用壽命短。如采用粘度低的線性聚合物如甲基纖維素代替聚丙烯酞胺,可形成無凝膠但有篩分作用的無膠篩分介質(zhì)，它能避免空泡形成,比凝膠柱制備簡單,壽命長,但分離能力比凝膠柱略差。

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毛細(xì)管凝膠電泳

用多孔性的凝膠或其它篩分劑作介質(zhì)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，按分子的體積大小和組分的質(zhì)荷比來進(jìn)行分離,大分子出來的快，小分子出來的慢。聚丙烯酰胺凝膠（PAG）：以丙烯酰胺為單體，甲叉雙丙烯酰胺作為交聯(lián)劑，由過硫酸銨與四甲基乙二胺為氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的自由基催化聚合而成。PAG的孔徑一般在3－30nm左右，適合分離核酸片段結(jié)構(gòu)。瓊脂糖凝膠（AG）：由瓊脂糖在氫鍵作用下結(jié)合而成，孔徑大，常用來分離蛋白質(zhì)分子和大的DNA片段。凝膠的種類CH2=CHCONH2CH2=CHC=ONHCH2NHCH2=CHC=O丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺毛細(xì)管凝膠電泳綜合了電泳技術(shù)和平板凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)：1.電泳峰尖銳，柱效極高2.短柱上實(shí)現(xiàn)極好的分離3.試樣容量為10－12g主要缺點(diǎn):制備柱較困難，壽命較短。已成為分離分析生物大分子如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、DNA等強(qiáng)有力的工具。例應(yīng)用CGE分離與激光誘導(dǎo)熒光檢測相結(jié)合，用于DNA序列快速分析。

22－2分離模

毛細(xì)管凝膠電泳三、毛細(xì)管凝膠柱制備技術(shù)毛細(xì)管凝膠柱的性能指標(biāo)(1)柱穩(wěn)定性(即柱壽命),這是評(píng)價(jià)毛細(xì)管凝膠柱的一個(gè)重要指標(biāo),各種柱制備方法都力求提高柱穩(wěn)定性,沒有高的穩(wěn)定性,就沒有遷移時(shí)間和峰面積的高度重現(xiàn)性;(2)柱分離效率;(3)遷移時(shí)間的重現(xiàn)性(在DNA序列分析中尤其重要)。在毛細(xì)管中制備聚丙烯酰胺凝膠通常包括以下幾步操作:(1)毛細(xì)管內(nèi)壁的處理a)用有機(jī)溶劑、堿液、水清洗毛細(xì)管內(nèi)壁;b)在毛細(xì)管內(nèi)壁鍵合雙官能團(tuán)試劑(如MAPS);c)使雙官能團(tuán)試劑與單體聚合形成一層聚合物薄膜。根據(jù)需要,有時(shí)可以省去操作c或者操作b和c。(2)預(yù)聚溶液的準(zhǔn)備(包括過濾、脫氣、引發(fā)劑的加入);(3)將預(yù)聚溶液導(dǎo)入毛細(xì)管;(4)使預(yù)聚溶液在毛細(xì)管中聚合;四、現(xiàn)有的交聯(lián)凝膠柱制備技術(shù)(1)Y.Baba法毛細(xì)管只用上節(jié)中操作(1)a進(jìn)行預(yù)處理,催化劑和引發(fā)劑濃度較低,柱中凝膠預(yù)聚溶液在比較溫和的條件下聚合,此法制得的柱子穩(wěn)定性較差,但在較低的場強(qiáng)下可以使用50多次,而且制備方法簡單,成功率較高,可以彌補(bǔ)穩(wěn)定性方面的不足。(2)B.L.Karger法毛細(xì)管依次用操作(1)a,b進(jìn)行處理,當(dāng)凝膠預(yù)聚溶液在管內(nèi)聚合時(shí),內(nèi)表面上的雙官能團(tuán)試劑與凝膠聚合在一起。這一類凝膠柱的穩(wěn)定性很高,報(bào)導(dǎo)過使用的最高記錄達(dá)200多次,并能忍受較高的場強(qiáng)。但是先鍵合在管壁上的雙官能團(tuán)試劑的烯烴雙鍵參與了凝膠形成,使得聚合過程中溶液流動(dòng)性變差,不利于未反應(yīng)溶液去填補(bǔ)體積收縮;另一方面,內(nèi)表面處理過的毛細(xì)管疏水性增加,潤濕性下降,在充入預(yù)聚溶液時(shí),本體溶液與管壁間可能存在極薄的間隙。這兩種因素都增加了聚合過程中形成凝膠缺陷的機(jī)會(huì)。(3)HP(惠普公司)專利方法這一方法的特點(diǎn)是對(duì)正在聚合的凝膠溶液施加高壓,使其體積收縮,收縮的程度與其聚合后體積收縮的程度相匹配。這種方法使用的壓力最少需要120個(gè)大氣壓,而且凝膠T值越大,所要求的壓力也越高。(4)H.F.Yin(尹紅峰)法毛細(xì)管依次用操作(1)a,b,c進(jìn)行處理,使管內(nèi)壁覆蓋一層線性聚合物涂層,增加了管內(nèi)壁的浸潤性,雙官能團(tuán)試劑不再參與聚合反應(yīng),配合使用高壓,減少了凝膠缺陷的產(chǎn)生,同時(shí)也極大地減小了電滲流,柱穩(wěn)定性相對(duì)提高。用這種方法制備的柱子,分離能力很強(qiáng),對(duì)400多堿基數(shù)的核苷酸片段達(dá)到單堿基差異分離。但這一方法并沒有得到廣泛應(yīng)用,可能是步驟較多,重復(fù)性較差。(5)J.A.Lux法這一方法的特點(diǎn)是以C射線引發(fā)聚合反應(yīng),避免APS2TEMED引發(fā)劑體系產(chǎn)生的荷電副產(chǎn)物對(duì)凝膠結(jié)構(gòu)的損害,反應(yīng)可以控制在較溫和的條件下進(jìn)行,而且一次可以制備多根毛細(xì)管凝膠柱,但推廣起來受輻射源的限制。(6)T.Wang法這一方法采用核黃素2TEMED體系作引發(fā)劑,在紫外光的照射下進(jìn)行游離基聚合反應(yīng),毛細(xì)管置于冰水浴中,聚合以較溫和的方式進(jìn)行,據(jù)報(bào)導(dǎo),成功率在80%以上,而且可以避免APS2TEMED引發(fā)體系殘存氮氧化物對(duì)分離對(duì)象的氧化作用;但使用的毛細(xì)管外涂層必須能透過紫外光。(7)V.Dolnik法這一方法采用漸次聚合的思想,即控制聚合反應(yīng)從毛細(xì)管一端開始,并逐步延伸到另一端,這樣聚合部分的體積收縮就有可能被前方未聚合的粘度較小的單體溶液不斷補(bǔ)充,從而減少了凝膠缺陷的形成。他們嘗試了4種控制方式,即溫度程序、漸次光聚合、激光引發(fā)光聚合和等速電泳法,最后認(rèn)為等速電泳法最為簡便可靠。用此法可以制備濃度較高的凝膠(T=30%),這是前幾種方法難以達(dá)到的。(8)陳義法這一方法的基本思路是加壓溫度梯度聚合,讓充滿凝膠預(yù)聚溶液的毛細(xì)管下端浸在40℃的水中,垂直的上端在冰水中,從上端加7～8個(gè)大氣壓,25℃室溫下,毛細(xì)管垂直懸掛;另一個(gè)操作是對(duì)毛細(xì)管兩端用雙官能團(tuán)試劑MAPS進(jìn)行處理,提高了柱穩(wěn)定性。用這種方法制備低濃度的柱子,成功率100%,高濃度柱子(T=15%～30%)成功率也在90%以上,穩(wěn)定性很高,使用時(shí)間可達(dá)70h以上。這一方法是目前制柱技術(shù)中水平較高的一種。五、凝膠缺陷的形成原因和避免措施傳統(tǒng)的凝膠電泳中,凝膠多制成薄層,這比較容易,但是要在內(nèi)徑幾十微米的毛細(xì)管中制成連續(xù)、穩(wěn)定、分離能力強(qiáng)的凝膠并不容易。由于凝膠在聚合過程中體積收縮,如果不斷縮小的體積不能及時(shí)得到補(bǔ)充,毛細(xì)管中將出現(xiàn)凝膠缺陷(亦稱為bubble或void)。在無凝膠缺陷的凝膠柱使用過程中,也可能出現(xiàn)凝膠缺陷并隨著使用時(shí)間而增大或增多。(1)電滲流效應(yīng)在負(fù)極端口電滲流對(duì)凝膠的推動(dòng)力缺少凝膠與管壁間摩擦力的抗衡,而管外的緩沖溶液對(duì)端口內(nèi)凝膠的靜壓力又遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以抗衡電滲推動(dòng)力,以致無法阻擋凝膠自負(fù)極端被推出。(2)離子貧化效應(yīng)同一種離子,在凝膠中與在管外緩沖溶液中的遷移數(shù)(即離子所運(yùn)載的相對(duì)電荷數(shù))不同。電泳過程中,離子通過凝膠與管外緩沖溶液界面處時(shí),將在此界面上引起離子濃度差異,在常用的PAG分離體系中其結(jié)果是在毛細(xì)管內(nèi)的負(fù)極端出現(xiàn)離子貧化區(qū),這一段的電阻增高,場強(qiáng)加大,電滲流效應(yīng)增強(qiáng)。(3)樣品效應(yīng)大樣品分子在經(jīng)過較小的凝膠網(wǎng)孔時(shí),會(huì)在進(jìn)樣的負(fù)極端堆積,在局部區(qū)域內(nèi)形成高電阻區(qū),場強(qiáng)增大,從而使電滲流效應(yīng)加強(qiáng);另外,殘留的大分子在電場作用下對(duì)凝膠網(wǎng)絡(luò)施加更大的壓力,網(wǎng)絡(luò)伸張引起的瞬時(shí)拉力對(duì)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生破壞作用。六、毛細(xì)管凝膠電泳的應(yīng)用凝膠的抗對(duì)流和分子篩作用的特點(diǎn)對(duì)分離大分子物質(zhì)最有利。毛細(xì)管凝膠電泳最主要的應(yīng)用方面是蛋白、多膚、寡聚核昔酸和DNA。1定量分析蛋白質(zhì)和多肽2研究寡聚糖核苷酸3DNA內(nèi)切片的分離我們?cè)谥苽浠蚴褂妹?xì)管凝膠柱時(shí)應(yīng)當(dāng)注意采取以下措施:(1)對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行涂層處理,盡量減小電滲流;(2)盡量避免使用會(huì)引起凝膠材料水解的緩沖溶液;(3)避免使用過高的場強(qiáng),在對(duì)凝膠柱施加或切斷電壓時(shí),要以較緩和的梯度方式進(jìn)行;(4)保存和使用凝膠柱時(shí)都應(yīng)當(dāng)盡可能地避免柱溫的急劇變化;(5)盡可能地了解分離對(duì)象的尺寸大小,據(jù)此選擇孔徑大小適當(dāng)?shù)哪z體系;(6)在緩沖溶液瓶中加入較稀的與凝膠體系相同的高分子單體溶液,以減小離子貧化效應(yīng)。

七、CGE技術(shù)的問題與展望（1）凝膠在制備過程中因劇烈的聚合反應(yīng)或者在使用過程中的高電壓(>350V/cm)下而產(chǎn)生一些氣泡。氣泡中斷了電路,使柱子報(bào)廢;另外,一些大的DNA分子的積留,也會(huì)嚴(yán)重影響柱壽命。（2）孔徑大小的控制一般通過凝膠濃度來實(shí)現(xiàn),但通過測定孔徑大小的范圍對(duì)柱參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法仍未解決。（3）分析重現(xiàn)性有待改善,這依賴于對(duì)分離條件(如電源、散熱、添加劑、緩沖體系及其pH值等)的研究和控制以及柱性能的改善。（4）檢測器尤其是激光誘導(dǎo)熒光檢測器技術(shù)還沒有成熟。八、相關(guān)文獻(xiàn)毛細(xì)管凝膠電泳法測定硫代寡核苷酸藥物癌泰得的含量癌泰得為20堿基的抑制端粒酶催化亞基hTERT的硫代反義寡核苷酸,體內(nèi)、體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)顯示其有較好的抗腫瘤活性。采用固相合成儀分別制備了癌泰得及與其堿基百分組成基本相同的硫代寡核苷酸內(nèi)標(biāo)，并使用制備型陰離子交換色譜和反相高效液相色譜進(jìn)行純化。毛細(xì)管凝膠電泳用于分析硫代寡核苷酸，可分離長度相差一個(gè)核苷酸的序列，因此使用CGE不僅可確定寡核苷酸的含量，而且可確定其代謝產(chǎn)物的組成和長短具有其他分析法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。采用毛細(xì)管凝膠電泳儀和單鏈分離試劑盒測定了癌泰得的含量。結(jié)論毛細(xì)管凝膠電泳法用于硫代寡核苷酸藥物癌泰得的定量分析，具有靈敏、線性范圍寬、精密度高、回收率好等優(yōu)點(diǎn)，而該法本身又具有樣品用量極少、可分離相差一個(gè)堿基寡核苷酸的優(yōu)點(diǎn)，因此為其藥代動(dòng)力學(xué)及毒代動(dòng)力學(xué)等研究奠定了基礎(chǔ)。部分交聯(lián)聚丙烯酰胺用于毛細(xì)管凝膠電泳蛋白質(zhì)分離

以高分辨低黏度可替換的部分交聯(lián)聚丙烯酰胺作為毛細(xì)管凝膠電泳的分離篩分介質(zhì),實(shí)現(xiàn)了溶菌酶、細(xì)胞色素C、核糖核酸酶A和胰蛋白酶4種堿性蛋白的基線分離.該聚合物材料具有的動(dòng)態(tài)涂漬能力減少了毛細(xì)管壁對(duì)蛋白質(zhì)的吸附,顯著改善了分離重現(xiàn)性.混合使用兩種部分交聯(lián)聚合物,分離分辨率和塔板數(shù)獲得進(jìn)一步提高.目前毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)絕大多數(shù)局限于蛋白質(zhì)分子量的測定,測定過程中蛋白質(zhì)需被變性處理,很少有應(yīng)用CGE分離分析活性蛋白質(zhì)的報(bào)道,然而只有實(shí)現(xiàn)活性蛋白質(zhì)的分離才能更好地為生物相關(guān)研究提供服務(wù),