第三節(jié)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來(lái)的技術(shù)，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。定義為了研究細(xì)胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各種生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)。生物類型G+細(xì)菌G-細(xì)菌酵母菌霉菌植物細(xì)胞主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(zhì)（6-8%）脂類（8.5-13.5%）多聚糖（幾丁質(zhì)）（80-90%）脂類蛋白質(zhì)初生壁次生壁細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)細(xì)菌破碎的主要阻力來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大，革蘭氏陰性細(xì)菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的堅(jiān)固；酵母葡聚糖的細(xì)纖維構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，甘露聚糖形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高；植物細(xì)胞次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅(jiān)硬性，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。常用破碎方法分類作用機(jī)理適應(yīng)性機(jī)械法珠磨法固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽(yáng)性菌超聲破碎法液體剪切作用對(duì)酵母菌效果較差，破碎過(guò)程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合非機(jī)械法酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價(jià)格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活機(jī)械法進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。1.珠磨法（Beadmill）原理：實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎設(shè)備有Mickle高速組織搗碎機(jī)、Braun勻漿器；中試規(guī)模的細(xì)胞破碎可采用膠體磨處理；在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機(jī)（瑞士WAB公司和德國(guó)西門子機(jī)械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法適用于細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理。膠體磨德國(guó)進(jìn)口珠磨機(jī)2.高壓勻漿法（High-pressurehomogenization）利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破碎，細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動(dòng)過(guò)程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。原理：——大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法，在微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理中常采用高壓勻漿器的排出閥易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌較小的革蘭氏陽(yáng)性菌含有包含體的基因工程菌不宜采用高壓勻漿法的細(xì)胞類型。影響勻漿破碎的主要因素：壓力、溫度、通過(guò)勻漿器閥的次數(shù)大、中、小型高壓勻漿器利用發(fā)射15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。一般認(rèn)為超聲波破碎的機(jī)理是：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。3.超聲破碎法（Ultrasonication）影響超聲波的細(xì)胞破碎效率因素：頻率、液體溫度和粘度、處理時(shí)間等。超聲波破碎法是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差。該法在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。非機(jī)械法1.酶溶法（EnzymaticLysis）（1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶等利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞時(shí)必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?，并確定相應(yīng)的次序。酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。酶溶法的缺點(diǎn)：溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差，產(chǎn)物抑制的存在。誘發(fā)微生物產(chǎn)生過(guò)剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。影響自溶過(guò)程的主要因素有溫度、時(shí)間、pH值、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。缺點(diǎn)：對(duì)不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速度下降。（2）自溶法（Autolysis）某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)。2.化學(xué)滲透法（Chemicalpermeation）TritonX-100牛黃膽酸鈉十二烷基磺酸鈉（1）表面活性劑表面活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。主要是處理G-細(xì)菌，對(duì)細(xì)胞外層膜有破壞作用。EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來(lái)填補(bǔ)，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強(qiáng)。（2）EDTA螯合劑能分解細(xì)胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來(lái)。乙醇、異丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級(jí)醇等。（3）有機(jī)溶劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。鹽酸胍和脲是常用的變性劑。通用性差；時(shí)間長(zhǎng)，效率低；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)滲透法優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過(guò)，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點(diǎn)，但不適應(yīng)于對(duì)冷凍敏感的生化物質(zhì)。其他方法1.X-press法將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破裂。僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過(guò)程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。2.滲透壓法（Osmoticpressure）將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次。

3.反復(fù)凍結(jié)-融化法此法使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。4.干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥破碎率的測(cè)定與破碎技術(shù)的研究方向

1.破碎率的測(cè)定直接測(cè)定法（革蘭氏染色法）目的產(chǎn)物測(cè)定法導(dǎo)電率測(cè)定法2.破碎技術(shù)的研究方向多種破碎方法相結(jié)合與上游過(guò)程相結(jié)合與下游工程相結(jié)合第四節(jié)固液分離定義：在一定的壓力差下，利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮液中的固體粒子，進(jìn)行固液分離的方法稱為過(guò)濾。一、過(guò)濾過(guò)濾介質(zhì)無(wú)定形顆粒：無(wú)煙煤、砂、顆?；钚蕴?、鐵礦砂等成形顆粒：燒結(jié)金屬、燒結(jié)塑料以及用合成樹(shù)脂粘結(jié)的硅砂、塑料顆粒等，做成圓筒形或板狀。非金屬織補(bǔ)棉：化學(xué)纖維、玻璃纖維織品、長(zhǎng)纖維濾布、短纖維濾布。金屬織布：不銹鋼絲或鐵絲等的織布。無(wú)紡品：紙、氈、石棉板、合成纖維無(wú)紡布等。過(guò)濾設(shè)備的分類根據(jù)推動(dòng)力的不同可分為四類重力過(guò)濾 自然過(guò)濾加壓過(guò)濾 板框過(guò)濾真空過(guò)濾 真空過(guò)濾器離心過(guò)濾 離心過(guò)濾器過(guò)濾設(shè)備板框過(guò)濾機(jī)板框壓濾機(jī)由壓濾機(jī)濾板、液壓系統(tǒng)、壓濾機(jī)框、濾板傳輸系統(tǒng)和電氣系統(tǒng)等五大部分組成。板框壓濾機(jī)工作運(yùn)行的原理：先由液壓施力壓緊板框組，料液由中間進(jìn)入，分布到各濾布之間，通過(guò)過(guò)濾介質(zhì)而實(shí)現(xiàn)固、液分離的脫液方法。廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過(guò)濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細(xì)菌（需預(yù)處理）等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。濾板與濾框的工作情況優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、裝配緊湊、過(guò)濾面積大、允許采用較大的操作壓力，輔助設(shè)備少，動(dòng)力消耗小，過(guò)濾和洗滌質(zhì)量好，對(duì)固形物含量要求低，材料選擇范圍廣。缺點(diǎn)：設(shè)備笨重、占地面積多、輔助時(shí)間長(zhǎng)、生產(chǎn)效率低。

板框過(guò)濾機(jī)真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)優(yōu)點(diǎn)：真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)具有自動(dòng)化程度高、操作連續(xù)、處理量大。特別適合固體含量大（>10％）的懸浮液的分離，在發(fā)酵工業(yè)中廣泛用于霉菌、放線菌和酵母發(fā)酵液或細(xì)胞懸浮液的過(guò)濾分離。缺點(diǎn)：由于受真空度的限制，不適于菌體較小和粘度較大的細(xì)菌發(fā)酵液的過(guò)濾，且過(guò)濾所得固相的干度不如加壓過(guò)濾。真空轉(zhuǎn)鼓過(guò)濾機(jī)二、離心定義：基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心場(chǎng)中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過(guò)程。離心分離方法1.差速離心—工業(yè)上最常用的離心分離方法定義：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。對(duì)象：混合樣品中各沉降系數(shù)差別較大的組分。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

原理：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。分類：1）移動(dòng)區(qū)帶離心

2）等密度離心常用密度梯度物質(zhì)：蔗糖、甘油、CsCl、NaBr2.

密度梯度離心—多用于生化研究1）移動(dòng)區(qū)帶離心用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。此法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。2）等密度離心細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和夠長(zhǎng)時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在該層達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。A移動(dòng)區(qū)帶離心B等密度離心離心機(jī)分類制備性離心機(jī)分析性離心機(jī)：超速離心機(jī)普通離心機(jī)高速冷凍離心機(jī)超速離心機(jī)實(shí)驗(yàn)型離心機(jī)工業(yè)型離心機(jī)碟片式離心機(jī)是傳統(tǒng)離心機(jī)，為目前工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的離心機(jī)。分離因數(shù)可達(dá)1000-20000，最大處理量達(dá)到300m3/h，常用于大規(guī)模的分離過(guò)程。適用范圍細(xì)菌、酵母菌、放線菌、細(xì)胞碎片管式離心機(jī)管式離心機(jī)是一種分離效率很高的離心分離設(shè)備，其轉(zhuǎn)鼓細(xì)長(zhǎng)，可在15000-50000的高轉(zhuǎn)速下工作，分離因數(shù)可達(dá)104-6×105。它設(shè)備簡(jiǎn)單、操作穩(wěn)定。