關于真核生物的基因調控第一頁，共89頁幻燈片一真核細胞的基因結構真核細胞與原核細胞在基因轉錄、翻譯及DNA的空間結構方面存在很大的差異，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：

1在真核細胞中，一條成熟的mRNA鏈只能翻譯出一條多肽鏈，即基因以多順反子的形式存在。

2真核細胞DNA與組蛋白和大量非組蛋白相結合，只有一小部分DNA是裸露的。第二頁，共89頁幻燈片3真核細胞中有一部分由幾個或幾十個堿基組成的DNA序列，在整個基因組中重復幾百次甚至上百萬次。高等真核細胞DNA中很大部分是不轉錄的。大部分真核細胞的基因中存在不被翻譯的內含子。

4真核生物能夠有序地根據生長發(fā)育階段的需要進行DNA片斷的重排，在需要時，可增加細胞內某些基因的拷貝數。第三頁，共89頁幻燈片5真核生物中，基因轉錄的調節(jié)區(qū)較大，它們可能遠離啟動子達幾百個甚至上千個堿基對，它主要是通過改變整個所控制基因5ˊ上游區(qū)DNA構型來影響它與RNA聚合酶的結合能力。

6真核生物的RNA在細胞核中合成，只有穿過細胞膜，到達細胞質后，才能被翻譯成蛋白質。

7許多真核細胞的基因需經過復雜的成熟和剪接過程（maturationandsplicing）才能順利地翻譯成蛋白質。第四頁，共89頁幻燈片第五頁，共89頁幻燈片第六頁，共89頁幻燈片第七頁，共89頁幻燈片二基因家族(genefamily)原核細胞中，整個體系置于一個啟動子控制之下。由于真核細胞的DNA都是單順反子，許多相關的基因常常按功能成套組合，一套基因就是一個基因家族。家族中各成員的表達水平和酶活性可以很不相同，但通常是密切相關的。通常分為簡單多基因家族、復雜多基因家族和發(fā)育調控的復雜多基因家族。第八頁，共89頁幻燈片1簡單多基因家族：指在家族中有一個或數個基因以串聯(lián)方式重復排列。如編碼ssrRNA的基因家族，其中每個ssrRNA基因都被規(guī)模宏大的間隔序列所分開。間隔序列的長度約為ssrRNA長度的2—6倍，并含有中等重復序列，每個ssrRNA基因都被單獨轉錄，產生獨立于其它部分的RNA分子，經加工為成熟的ssrRNA。第九頁，共89頁幻燈片2復雜多基因家族：一般由幾個相關基因家族構成，基因家族之間由間隔序列隔開，并作為獨立的轉錄單位。如：海膽的組Pr基因家族。第十頁，共89頁幻燈片

組蛋白（海膽）

組蛋白（果蠅）第十一頁，共89頁幻燈片3發(fā)育調控的復雜多基因家族

在生物體發(fā)育的不同階段，復雜多基因家族中的基因結構和數量，會發(fā)生變化的情況，基因之間存在著具有調節(jié)功能的重復序列。在每個基因家族中，基因排列的順序就是它們在發(fā)育階段的表達順序。如人類的血紅蛋白，在母體懷孕后的不同時期出現(xiàn)不同的亞基和數量變化。第十二頁，共89頁幻燈片第十三頁，共89頁幻燈片三真核基因的斷裂結構1外顯子和內含子：現(xiàn)已查明，大多數真核基因都是由Pr編碼序列和非Pr編碼序列組成。編碼序列稱為外顯子（exon），非編碼序列稱為內含子（intron）。在一個結構基因中，編碼某一Pr不同區(qū)域的各個外顯子并不連續(xù)地排列在一起，而常常被長度不等的內含子所隔離，形成鑲嵌排列的斷裂方式，所以真核基因有時稱為斷裂基因(interruptedgene)。只有真核基因具有切除基因中內含子，產生功能型mRNA和Pr的能力，原核生物不具有此種特性。第十四頁，共89頁幻燈片觀察研究外顯子和內含子的方法：

1.電子顯微鏡：將成熟mRNA分子和相應的染色體DNA進行分子雜交，形成DNA-RNA異源雙鏈分子（heterdaplexes）,在電鏡下可觀察到部分單鏈DNA區(qū)段從異源雙鏈分子上呈環(huán)狀突起，表示這序列在成熟mRNA分子上已被切除，為內含子。第十五頁，共89頁幻燈片2.用S1核酸酶處理異源雙鏈分子：

S1核酸酶能專一降解未配對的單鏈核苷酸，基因組DNA中只有與成熟mRNA鏈相對應的片斷，由于形成異源雜合體而得以保留。這些保留下來的DNA片斷就是外顯子。根據對全序列的分析，它們的大小和在DNA鏈上的特定位置都能被精確地測定。第十六頁，共89頁幻燈片3限制性內切酶切圖譜分析：采用幾種不同的限制性內切酶，綜合分析DNA的酶切圖譜和成熟mRNA分子一的酶切位點的分布，就可確定內含子的大小及其在基因中與外顯子的排列方式。第十七頁，共89頁幻燈片2外顯子與內含子的可變性：在基因轉錄、加工產生成熟mRNA分子時，內含子通過剪接加工被去除，保留在成熟mRNA分子中的外顯子被拼接在一起，最終被翻譯成蛋白質。因此，通過反轉錄酶的作用，由成熟mRNA產生的cDNA分子中，只含有外顯子，沒有內含子。第十八頁，共89頁幻燈片外顯子和內含子的關系并不是完全固定不變的，有時會出現(xiàn)這樣的情況：在同一條DNA鏈上的某一段DNA序列，它作為編碼茉一條多肽鏈基因的一部分時是外顯子，但作為編碼另一條多肽鏈基因的一部分時，則成了內含子，這是由于mRNA剪接加工的方式不同造成的。其結果是同一段DNA序列加工生成了兩條或兩條以上的mRNA鏈。第十九頁，共89頁幻燈片3外顯子與內含子的連接區(qū)：真核基因斷裂結構的另一個重要特點是外顯子-內含子連接區(qū)（exon-intronjunction）的高度保守性和特異性堿基序列。外顯子-內含子連接區(qū)就是指外顯子和內含子的交界，又稱邊界序列。有兩個重要特征：第二十頁，共89頁幻燈片1.內含子的兩端序列之間沒有廣泛的同源性，因此內含子兩端序列不能互補，即上游序列和下游序列不可能通過堿基配對形成發(fā)卡式二級結構。

2.外顯子-內含子連接區(qū)很短，但卻高度保守（consensussequence），它是RNA剪接的信號序列。第二十一頁，共89頁幻燈片序列分析表明：幾乎每個內含子5ˊ端起始的兩個堿基都是GT，3ˊ端最后兩個堿基總是AG，由于這兩個堿基的高度保守性和存在的廣泛性，將其稱為GT-AG法則，即5ˊGT…AG3ˊ。第二十二頁，共89頁幻燈片四真核生物DNA水平的調控1基因丟失：某些原生動物、昆蟲及甲殼綱動物細胞分化過程中發(fā)現(xiàn)有部分染色體丟失的現(xiàn)象。這種方式僅存在于進化程度較低的生物中，如馬蛔蟲。

2基因擴增：指某些基因的拷貝數專一性大量增加的現(xiàn)象，它使得細胞在短期內產生大量的基因產物以滿足生長發(fā)育的需要。是基因活性調控的一種方式。第二十三頁，共89頁幻燈片如：非洲爪蟾的卵母細胞中原有rRNA（rDNA）基因約500個拷貝，在減數分裂Ⅰ的粗線期內，這個基因開始迅速復制，到雙線期，其copy數達200萬個，增加近4000倍，可用來合成1012個rRNA，以滿足卵裂期間和胚胎期間合成大量Pr的需要。第二十四頁，共89頁幻燈片3.基因重排與變換：一個基因可以通過從遠離其啟動子的地方移到距它很近的位點而被啟動轉錄，這種方式稱基因重排。典型的例子是小鼠免疫球Pr結構基因的表達，免疫球Pr肽鏈主要由可變區(qū)、恒定區(qū)及兩者之間的連接區(qū)組成，在未分化的細胞中（胚胎細胞中）三者相距較遠。當淋巴細胞發(fā)育分化時，能通過染色體內的重組，把三個遠離的基因緊密地連接在一起，從而產生免疫球Pr。第二十五頁，共89頁幻燈片

基因的重排與變換

一個基因可以通過從遠離其啟動子的地方移到距它很近的位點而被啟動轉錄，這種方式稱為重排。通過基因重排調節(jié)基因活性的典型例子是小鼠免疫球蛋白結構基因的表達。

VDJCμCα

E未分化細胞

VDJCμCα

E

產生Cμ細胞VDJCαE產生Cμ細胞

類型轉換

免疫球蛋白中連基因的組織特一行表達與基因重排

V.可變區(qū);D.多態(tài)區(qū);J.結合區(qū)

第二十六頁，共89頁幻燈片五順式作用元件與基因調控1染色質結構對轉錄的影響：轉錄發(fā)生之前，染色質常常會在特定的區(qū)域被解旋或松馳，形成自由DNA。這種變化包括核小體結構的消除或改變，DNA本身局部結構的變化如雙螺旋的局部超旋或松馳，DNA從B-DNA變?yōu)閆-DNA等。這些變化導致結構基因暴露，促進轉錄因子與啟動區(qū)DNA的結合，從而導致基因的轉錄。第二十七頁，共89頁幻燈片1、染色體水平的調控

A、染色體結構的改變Tu1Tu2

染色質結構變化影響基因轉錄染色質去超螺旋基因轉錄

真核基因的活躍轉錄是在常染色質上進行的。轉錄發(fā)生之前，染色質常常會在特定的區(qū)域被解旋或松弛，形成自由DNA。這種變化可能包括核小體結構的消除或改變，DNA本身局部結構的變化，如雙螺旋的局部超旋或松弛，DNA從右旋型變?yōu)樽笮停╖-DNA）等。這些變化可導致結構基因暴露，促進轉錄因子與啟動區(qū)DNA的結合，從而導致基因轉錄。多線染色體第二十八頁，共89頁幻燈片活躍表達的基因所在的染色質上含有對DNaseⅠ的超敏感位點(hypersensitivesite)，即率先降解位點。每個活躍表達基因都有一個或數個超敏感位點，大多位于基因5ˊ端啟動區(qū)。每個超敏感位點是一段長約100-200bp的DNA序列。非活躍基因的5ˊ端相應位點不表現(xiàn)對DNaseⅠ的超敏感性。第二十九頁，共89頁幻燈片

3啟動子及其對轉錄的影響：真核生物基因轉錄的起始位點具有“帽子”結構專一性，而且只有嘌呤（以腺嘌呤為主）才能起始轉錄。調控區(qū)較大，除具有結合RNA聚合酶Ⅱ的CAAT區(qū)之外，大多數基因還擁有GC區(qū)和增強子。第三十頁，共89頁幻燈片幾乎所有真核基因3ˊ端都存在一個poly（A）位點，該位點上游15-30bp處的保守序列AATAAA對于初級轉錄產物的準確切割及加poly（A）是必需的，初級轉錄產物的終止是AATAAA和終止區(qū)之間相互作用的結果。新生RNA在poly（A）位點的準確剪切加工則通過AATAAA區(qū)和poly（A）位點周圍序列的相互作用來達到。第三十一頁，共89頁幻燈片真核生物的啟動子：所謂啟動子是指確保轉錄精確而有效地啟始的DNA序列。真核基因啟動子在由RNA聚合酶Ⅱ催化轉錄的DNA序列5ˊ上游區(qū)富含TA的保守序列，該序列前4個堿基為TATA，所以稱為TATA框（TATAbox，或TATA區(qū)）。TATA區(qū)的主要作用是使轉錄精確地起始；CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉錄起始的頻率，不參與起始位點的確定。第三十二頁，共89頁幻燈片現(xiàn)在認為啟動子-25～-35區(qū)含有TATA序列，在-70～-80區(qū)有CCAAT序列（CAATbox），在-80～-110區(qū)含有GCCACACCC或GGGCGGG（GCbox）。習慣上將TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動子元件（upstreampromoterelement,UPF）或稱上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）。第三十三頁，共89頁幻燈片Sequenceelementswithinatypicaleukaryoticgene1GCTATACAATGC-25-50-80-95-1301

basedonthethymidinekinasegene

octamertranscriptionelementpromoterTATAbox(TATAAAA)

locatedapproximately25-30bpupstreamofthe+1startsite

determinestheexactstartsite(notinallpromoters)bindstheTATAbindingprotein(TBP)whichisasubunitofTFIIDGCbox(CCGCCC)

bindsSp1(Specificityfactor1)

CAATbox(GGCCAATCT)

bindsCTF(CAATboxtranscriptionfactor)

Octamer(ATTTGCAT)

bindsOTF(Octamertranscriptionfactor)+1ATTTGCAT第三十四頁，共89頁幻燈片RNA聚合酶II啟動子

第三十五頁，共89頁幻燈片第三十六頁，共89頁幻燈片2增強子及其對轉錄的影響：增強子是指能使和它連鎖的基因轉錄頻率明顯增加的DNA序列。目前在病毒、植物、動物和人類正常細胞中都發(fā)現(xiàn)有增強子存在，是基因表達的重要調控元件。通常具有下列性質：

a增強效應十分明顯，一般能使基因轉錄頻率增加10—200倍，有的可增加上千倍。第三十七頁，共89頁幻燈片第三十八頁，共89頁幻燈片B.增強效應與其位置和取向無關，不論增強子以什么方向排列（5ˊ→3ˊ或3ˊ→5ˊ），甚至和基因相距3000bp，或在基因的下游，均表現(xiàn)出增強效應。c.大多為重復序列，一般長約50bp，適合與某些蛋白因子結合。其內部常含有一個核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），該序列是在另一個基因附近產生增強效應時所必需的。第三十九頁，共89頁幻燈片d.其增強效應有嚴密的組織和細胞特異性，說明只有特定的Pr（轉錄因子）參與才能發(fā)揮功能。

e.沒有基因專一性，可在不同的基因組合上表現(xiàn)出增強效應。

f.許多增強子還受外部信號的調控，如金屬硫蛋白的基因啟動區(qū)上游所帶的增強子，就可以對環(huán)境中的鋅、鎘濃度做出反應。第四十頁，共89頁幻燈片六反式作用因子對轉錄的調控

反式作用因子也稱轉錄因子，基因的所有順式作用元件都要和相應的反式作用因子結合，并通過Pr之間的相互作用才能實現(xiàn)它們對基因的調控。順式作用元件和反式作用因子結合形成轉錄復合體，根據各個Pr成分在轉錄中的作用，能將整個復合體分為3部分第四十一頁，共89頁幻燈片1.參與所有或某些轉錄階段的RNA聚合酶亞基，不具有基因特異性。

2.與轉錄的起始或終止有關的輔助因子，也不具有基因特異性。

3.與特異調控序列結合的轉錄因子，具基因特異性，如TATA區(qū)。第四十二頁，共89頁幻燈片特異轉錄因子對基因表達的調控是大量的、廣泛存在和高度有序的，主要有兩種形式：

1)轉錄起始復合物形成過程受到控制。

2)通過專一因子的結合，提高RNA聚合酶起始轉錄活性。第四十三頁，共89頁幻燈片1CAAT區(qū)結合蛋白CTF/NF1：

CTF和NF1是CAAT區(qū)的結合蛋白，是腺病毒復制所必需的。CTF/NF1是一組具雙重功能的蛋白質，它們與CTTA區(qū)相結合，參與促進RNA聚合聚合酶Ⅱ指導的轉錄起始過程；當它們與其它相似于CAAT區(qū)的DNA序列相結合，則有利于起始DNA的復制。第四十四頁，共89頁幻燈片2TATA和GC區(qū)結合蛋白：

TATA和GC區(qū)結合蛋白主要是RNA聚合酶Ⅱ起始一般基因轉錄所必需的4種Pr因子，有TFⅡD、TFⅡA、TFⅡB、TFⅡE。

TFⅡD：與TATA區(qū)相結合。

TFⅡA：參與TFⅡD和TATA區(qū)的結合。

TFⅡB：幫助RNA聚合酶Ⅱ與啟動區(qū)結合。

TFⅡE：幫助RNA聚合酶起始基因轉錄。第四十五頁，共89頁幻燈片表

RNA聚合酶Ⅱ的基本轉錄因子轉錄因子分子量(kD)功能TBP30與TATA盒結合TFⅡ-B33介導RNA聚合酶Ⅱ的結合TFⅡ-F30,74解旋酶TFⅡ-E34,37ATP酶TFⅡ-H62,89解旋酶TFⅡ-A12,19,35穩(wěn)定TFⅡ-D的結合TFⅡ-I120促進TFⅡ-D的結合第四十六頁，共89頁幻燈片第四十七頁，共89頁幻燈片PhosphorylationofthepolymeraseCTDbyTFIIHFormationofaprocessiveRNApolymerasecomplexandallowstheRNAPoltoleavethepromoterregion.Back第四十八頁，共89頁幻燈片3RNA聚合酶Ⅲ及其下游啟動區(qū)結合蛋白：

RNA聚合酶Ⅲ主要結合在轉錄起始位點的下游50bp以上區(qū)，有許多輔助因子參與RNA聚合酶Ⅲ對不同啟動區(qū)的識別和結合，如轉錄因子TFⅢA參與該酶對非洲爪蟾5SrRNA的轉錄。第四十九頁，共89頁幻燈片第五十頁，共89頁幻燈片TFⅢA具鋅指結構域（鋅指區(qū)Zincfingerregion）:TFⅢA蛋白有9個相似的重復單位，每個單位大約由30個AA殘基組成，每個單位中有一對固定位點的半胱氨酸殘基，一對固定的組AA殘基，它們和Zn離子絡合，使中間的AA殘基回折成一種手指狀結構，稱鋅指或鋅指區(qū)。第五十一頁，共89頁幻燈片SP1鋅指結構域Zincfingersmayformα-helicesthatinsertintothemajorgroove,associated

withβ-sheetsontheotherside第五十二頁，共89頁幻燈片ThefirstfingerofasteroidreceptorcontrolsspecificityofDNA-binding(positionsshowninred);thesecondfingercontrolsspecificityofdimerization(positionsshowninblue).TheexpandedviewofthefirstfingershowsthatdiscriminationbetweenGREandEREtargetsequencesrestsontwoaminoacidsatthebase.第五十三頁，共89頁幻燈片4常見的反式作用因子中的DNA識別或結合域：1螺旋-轉折-螺旋（helix-turn-helix,H-T-H）結構：這一類蛋白質分子中至少有兩個α螺旋，中間由短側鏈AA殘基形成“轉折”，近羧基端的α螺旋中氨基酸殘基的替換會影響該蛋白質在DNA雙螺旋大溝中的結合。第五十四頁，共89頁幻燈片Thehelix-turn-helixdomain第五十五頁，共89頁幻燈片HTH結構及其與DNA的結合第五十六頁，共89頁幻燈片2.鋅指（Zincfinger）結構:鋅指結構家族蛋白大體可分為鋅指、鋅鈕（twist）和鋅簇（cluster）結構，基特有的半胱氨酸和組氨酸殘基之間氨基酸殘基數基本恒定，有鋅參與時才具備轉錄調控活性。這類蛋白質與DNA的結合很牢固，特異性也很高。第五十七頁，共89頁幻燈片蛋白質的鋅指結構第五十八頁，共89頁幻燈片Thezincfingerdomain第五十九頁，共89頁幻燈片back…第六十頁，共89頁幻燈片3.堿性-亮氨酸拉鏈(basic-leucinezipper):即bZIP結構。在許多調控蛋白中發(fā)現(xiàn)的一段富含亮AA的序列，這個區(qū)域易形成α螺旋或卷曲螺旋的構象，具有這種“拉鏈”形式的兩個蛋白就能形成穩(wěn)定的二聚體。拉鏈區(qū)以外的AA大都呈堿性，具的結合DNA的本領。第六十一頁，共89頁幻燈片Back…第六十二頁，共89頁幻燈片ThebasicregionsofthebZIPmotifareheldtogetherbythedimerizationattheadjacentzipperregionwhenthehydrophobicfacesoftwoleucinezippersinteractinparallelorientation.第六十三頁，共89頁幻燈片Back第六十四頁，共89頁幻燈片4.堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basic-helix/loop/helix）：即bHLH結構。在免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子結合蛋白E12與E47中，羧基端100-200個氨基酸殘基可形成兩個雙性α螺旋，被非螺旋的環(huán)狀結構所隔開，蛋白質的氨基端是堿性區(qū)，其DNA結合特性與亮AA拉鏈類蛋白相似。肌細胞定向分化的調控因子MyoD-1、原癌基因產物Myc及其結合蛋白Max等都屬于bHLH蛋白。研究發(fā)現(xiàn)：bHLH類蛋白只有形成同源或異源二聚體時，才具有足夠的DNA結合能力。第六十五頁，共89頁幻燈片5.同源域蛋白（homeodomains）是指編碼60個保守氨基酸序列的DNA片斷，廣泛存在于真核生物基因組內，與生物有機體的生長、發(fā)育和分化密切相關。許多含有同源轉換區(qū)的基因具有轉錄調控的功能，同源轉換區(qū)AA序列很可能參與形成了DNA結合區(qū)。第六十六頁，共89頁幻燈片5轉錄活化結構域：在真核核生物中，反式作用因子的功能受Pr-Pr之間相互作用的調節(jié)，完整的轉錄調控功能通常以復合物的方式來完成，所以并不是每個轉錄因子都直接與DNA結合。因此，是否具有轉錄活化域成為反式式作用因子中唯一的結構基礎。第六十七頁，共89頁幻燈片反式作用因子的功能具有多樣性，其轉錄活化域也有多種，通常依賴于DNA結合結構域以外的30-100個氨基酸殘基。不同的轉錄活化域有下列幾個特征性結構：

1)帶負電荷的螺旋結構：哺乳動物細胞中糖皮質激素受體的兩個轉錄活化域都有酸性的螺旋結構，能特異性誘導轉錄起始的活性并不是很強，它們可能與TFⅡD復合物中某個通用因子或RNApolymeraseⅡ本身結合，并有穩(wěn)定轉錄起始復合物的作用。第六十八頁，共89頁幻燈片2)富含谷氨酰胺的結構：如SP1是啟動子GCbox的結合蛋白，除結合DNA的鋅指結構以外，SP1共有4個參與轉錄活化的區(qū)域，其中最強的轉錄活化域富含谷氨酰胺占該區(qū)AA總數的25%左右。3)富含脯AA的結構：第六十九頁，共89頁幻燈片七激素及其影響許多類固醇激素（如雌性激素、孕激素、醛固酮、糖皮質激素和雄激素）以及一般的代謝性激素（胰島素），它們的調控作用是通過啟始轉錄而實現(xiàn)的。固醇類激素是疏水性分子，可以自由出入細胞膜。靶細胞具有專一的細胞質受體，可與激素形成復合物，三維結構甚至化學性質變化。第七十頁，共89頁幻燈片類固醇第七十一頁，共89頁幻燈片激素至少以5種方式啟動基因的轉錄：

1激素直接與DNA結合，促進RNA聚合酶或其它蛋白因子與轉錄起始區(qū)的相互作用。

2激素與效應物相結合，改變其構象，并使之易于結合到DNA上，促進RNA聚合酶與啟動區(qū)的結合。

3由于激素的存在，已經與DNA結合的某個蛋白質被激活，并且該Pr的這種形式是RNA聚合酶結合時所必須的。

4激素是誘導物，它可以使阻礙物失活。

5激素引起染色質的結構改變，暴露DNA，以促進RNA聚合酶的結合。第七十二頁，共89頁幻燈片八其它水平上的基因調控1RNA的加工成熟：

rRNA：分子內切割、化學修飾——甲基化（原核：堿基甲基化；真核：核糖甲基化）

tRNA：先生成tRNA前體，再加工成熟。

mRNA：先生成核不均一RNA（hnRNA），再加工剪輯，即切掉內含子，連接外顯子。第七十三頁，共89頁幻燈片2翻譯水平的調控：主要表現(xiàn)在三個方面：

1)Pr合成起始速率的調節(jié)。

2)mRNA的識別：與5ˊ帽子結構密切相關。

3)激素的影響。第七十四頁，共89頁幻燈片3Pr的加工成熟

1多肽的切割加工與Pr分泌有關的切割?！づcPr活化有關的切割。上述兩種均在高爾基體內進行信號肽的切除。

2多肽的有限水解：初生的Pr以Pr原或酶原形式存在，無生物活性，經過有限的酶解或化學水解成為有活性的物質。

3多肽的化學修飾：

Pr的磷酸化?！r的糖基化。第七十五頁，共89頁幻燈片九真核基因在原核中的表達：（一）真核基因在原核中表達有下述特點：

1細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子。

2真核基因轉錄的mRNA缺乏SD序列，不能結合到原核細胞的核糖體上，不能啟動翻譯過程。

3真核基因含有內含子（intron），原核細胞缺乏真核細胞轉錄的外加工體系，不能切除內含子，無法表達出真核蛋白。第七十六頁，共89頁幻燈片4表達的真核蛋白在原核細胞中不穩(wěn)定，易被細菌蛋白酶破壞。5用于表達的真核基因，必須刪除信號肽編碼序列，才能表達出成熟的蛋白質。因大腸桿菌缺乏真核表達系統(tǒng)的加工后處理功能，連同信號肽一并表達出的真核蛋白前體是無生物活性的。第七十七頁，共89頁幻燈片6對于必須糖基化修飾的真核蛋白，由于原核細胞缺乏真核細胞特有的糖基化修飾作用，故無法得到具有生物功能的真核糖基化修飾蛋白。

7外源基因在原核細胞表達后，常以不溶性的包含體（includingbody）形式存在，它需經變性-復性(refolding)處理后，才能得到具有生物活性的蛋白質。第七十八頁，共89頁幻燈片（二）真核基因在大腸桿菌中的幾種表達方式1融合蛋白：指蛋白的N末端由原核DNA序列或其它DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。這樣的Pr由一條短的原核多肽或具有其它功能的多肽和真核Pr結合在一起，故稱為融合蛋白。第七十九頁，共89頁幻燈片融合蛋白的特點：

1在細菌內比較穩(wěn)定，容易高效表達。

2基因操作比較簡單。

3表達的融合蛋白經化學處理（CNBr），或特異Pr酶（如凝血因子Ⅹ，膠原酶、凝血酶、腸激肽酶等）水解可以切除融合Pr氨基端的原核多肽，從而獲得有生物活性的真核