第二章菌種制備微生物的菌種制備在微生物工業(yè)應(yīng)用中，微生物菌種工作主要包括以下四方面：①菌種的分離篩選：挑選符合生產(chǎn)要求的菌種，這是選種工作的任務(wù)。②菌種培育：改良已有菌種的生產(chǎn)性能，使產(chǎn)品的質(zhì)和量不斷提高，或使它更適應(yīng)于工藝的要求，這是育種工作的任務(wù)。③菌種的保藏：一切生產(chǎn)菌種都要使它避免死亡和生產(chǎn)性能的下降，這是菌種保藏工作的任務(wù)。④退化菌種的復壯：如果發(fā)現(xiàn)菌種的生產(chǎn)性能下降，就要設(shè)法使它恢復，這便是菌種復壯工作的任務(wù)。一、菌種制備微生物資源及其豐富，它們棲居了自然界的各個角落。按研究和生產(chǎn)的需要進行采集，經(jīng)過反復分離篩選獲得需要的抗生素產(chǎn)生菌，成為原始菌種。原始菌種往往產(chǎn)量較低，發(fā)酵時易產(chǎn)生色素和伴生大量不需要或有害的其他代謝產(chǎn)物，需進一步選育或基因重組獲得生產(chǎn)上需要的高產(chǎn)優(yōu)良菌種，生產(chǎn)上習慣稱為產(chǎn)生菌種?？股禺a(chǎn)生菌的分離和篩選土壤微生物的分離采土：到富集抗生素產(chǎn)生菌的土壤中采土分離：取5～10g土樣，以無菌水稀釋1000～10000倍，吸取0.05ml涂布于培養(yǎng)基上。一、從自然界中分離篩選菌種的方法步驟采樣

增殖培養(yǎng)

純種分離純培養(yǎng)生產(chǎn)性能測定方法、地點、時間和周圍環(huán)境記錄純種分離的原則就是使培養(yǎng)物獲得單個菌落：1．稀釋分離法2．平板劃線分離法

⑴

涂菌：

⑵

劃線分離：①分步劃線法；②一次劃線法：

3．組織分離法

測定代謝產(chǎn)物或其它目的性狀篩選從大量待篩的微生物中，盡快鑒別少數(shù)有應(yīng)用價值的抗生素產(chǎn)生菌的實驗過程。要根據(jù)篩選的目的，選擇合適的篩選方法。方法：瓊脂移塊法、發(fā)酵液擴散法、篩選抗腫瘤抗生素法、抗病毒抗生素的篩選、酶抑制劑的特異篩選方法。紙片培養(yǎng)顯色法

透明圈法瓊脂塊培養(yǎng)法

二、菌種選育的經(jīng)典方法自然選育誘變育種自然選育概念：利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理，通過篩除衰退型菌株，選擇維持原有生產(chǎn)水平的菌株的純種選育的方法。進一步選育或保藏移種生產(chǎn)菌種斜面制備單孢子懸浮液分離出單菌落斜面種子(初篩)高產(chǎn)菌株沙土管菌株斜面種子搖瓶復篩高產(chǎn)純化株生產(chǎn)試驗自然選育流程圖篩選：將分離培養(yǎng)后的各型單菌落接斜面培養(yǎng)，成熟后接入搖瓶，測定其發(fā)酵生產(chǎn)能力的過程。初篩：以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。復篩：則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。優(yōu)點：簡單易行缺點：效率低、進展慢

以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種機率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。（一）誘變育種的一般步驟和方法

出發(fā)菌株

同步培養(yǎng)

使菌細胞處于相同或接近的生理狀態(tài)

單細胞（或單孢子）菌懸液的制備

單細胞或單孢子的意義

酵母或霉菌孢子106/ml、細菌108/ml

誘變劑的選擇及其劑量的確定

以致死率為90％～99％

為宜

誘變處理

①物理誘變劑

②化學誘變劑

確定出發(fā)菌株

↓菌種的純化選優(yōu)

↓←出發(fā)菌株的性能鑒定同步培養(yǎng)

↓制備單細胞（或單孢子）懸液

↓←活菌濃度測定誘變劑的選擇與確定誘變劑量的預試驗

↓誘變處理

↓平板分離

↓計形態(tài)變異的菌落數(shù)，計算突變率挑取疑似突變菌落純培養(yǎng)

↓突變體的初步篩選

↓←用簡單快捷的方法重復篩選

↓←搖瓶發(fā)酵試驗選出突變體（根據(jù)情況進行生產(chǎn)試驗或重復誘變處理）二、微生物的誘變育種三、現(xiàn)代菌種選育技術(shù)1、雜交育種：指兩個不同基因型的菌株通過接合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離，篩選出具有新性狀的菌株。一般包括以下過程：標記菌株的選擇→異核體的形成→雜合二倍體的形成→重組體的轉(zhuǎn)化→重組體遺傳性狀的分析2、原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體融合育種

細胞（A+B—）

細胞（A—B+）

脫壁處理

脫壁處理

原生質(zhì)體（A+B—）

原生質(zhì)體（A—B+）

混合

加融合劑

原生質(zhì)體融合

涂平板（原生質(zhì)體再生）

形成菌落

檢出重組子菌落（A+B+）3、基因工程育種程序：1、目的基因的準備2、載體系統(tǒng)3、基因與載體連接4、轉(zhuǎn)化5、重組體的篩選和表達產(chǎn)物的鑒定防止菌種退化的措施

1．控制傳代次數(shù)

2．創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件

3．利用不同類型的細胞進行移種傳代

4．采用有效的菌種保藏方法四、菌種的保藏

1．低溫保藏法斜面菌種直接放入0～4℃冰箱中保藏，保存時間不宜過長，一般為

3～6個月；用-20℃以下的超低溫冰箱或干冰、液氮（-195℃）凍結(jié)保藏，長達數(shù)年。

2．干燥保藏法主要是指把菌種接種到適當載體上，在干燥條件下進行保藏。這種保藏方法主要適合于細菌的芽胞和霉菌的孢子。細菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麩皮管保藏。

3．隔絕空氣保藏法用固體石蠟密封試管口以隔絕空氣，

4．真空冷凍干燥保藏法其基本過程是：培養(yǎng)菌種→加菌種保護劑（一般食品工業(yè)用菌種多用牛乳作保護劑）→分裝、預凍→真空凍干→真空封口。

培養(yǎng)基的制備在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中，由于各菌種的生理生化特性不一樣，采用的工藝也不同，所需的培養(yǎng)基組成亦各異。即使同一菌種。在種子的培養(yǎng)階段和不同的發(fā)酵時期，其營養(yǎng)的要求也不完全一樣。因此需根據(jù)其不同要求來選用培養(yǎng)基的成分和配比。其主要成分包括：碳源、氮源、無機鹽類（包括微量元素）、前體等培養(yǎng)基各成分說明碳源：主要用以供給菌種生命活動所需的能量，構(gòu)成菌體細胞及代謝產(chǎn)物。有的碳源還參與抗生素的生物合成，是培養(yǎng)基中主要成分。氮源：主要用以構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)和含氮代謝物，亦包括用以生物合成含氮抗生素。無機鹽和微量元素：抗生素產(chǎn)生菌和其他微生物一樣，在生長。繁殖和產(chǎn)生生物成品過程中，需要某些無機鹽類和微量元素，其濃度與菌種的生理活性有一定的影響。前體：在抗生素合成中，菌體利用它構(gòu)成抗生素分子中的一部分而其本身又沒有顯著改變的物質(zhì)稱為前體。前體除參與產(chǎn)物合成，在一定的條件下還控制合成抗生素的方向和抗生素的產(chǎn)量。孢子制備生產(chǎn)用的菌株需經(jīng)純化和生產(chǎn)能力的檢驗，符合規(guī)定的才能用來制備種子。制備孢子時，將保藏的處于休眠狀態(tài)的孢子，通過嚴格的無菌手續(xù)，將其接種到經(jīng)滅菌過的固體斜面培養(yǎng)基上，在一定溫度下培養(yǎng)5～7天或7天以上，必要時還可以進一步用扁瓶在固體培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)。種子制備其目的是使孢子發(fā)芽、繁殖以獲得足夠數(shù)量的菌絲，并接種到發(fā)酵罐中，種子制備可用搖瓶培養(yǎng)后再接入種子罐進行逐級擴大培養(yǎng)?；蛘咧苯訉㈡咦咏尤敕N子罐后逐級放大培養(yǎng)。種子擴大培養(yǎng)級數(shù)的多少，決定于菌種的性質(zhì)、生產(chǎn)規(guī)模的大小和生產(chǎn)工藝的特點。擴