原核生物及真核生物DNA復(fù)制內(nèi)容提要：●DNA的半保留復(fù)制●與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)●DNA的復(fù)制過程（大腸桿菌為例）●DNA復(fù)制的其它方式●真核生物中DNA的復(fù)制特點1、定義：由親代DNA生成子代DNA時，每個新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式稱半保留復(fù)制。（一）DNA的半保留復(fù)制（semi-conservativereplication）（二）與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)1、原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)2、模板：以DNA的兩條鏈為模板鏈，合成子代DNA3、引物：DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物4、引物合成酶（引發(fā)酶）：此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物（Primer)。實質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。5、DNA聚合酶:以DNA為模板的DNA合成酶●以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物●反應(yīng)需要有模板的指導(dǎo)●反應(yīng)需要有3-OH存在●DNA鏈的合成方向為53原核生物中的DNA聚合酶(大腸桿菌）性質(zhì)聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ3'5'外切活性+++5'3'外切活性+--5'3'聚合活性+中+很低+很高新生鏈合成--+主要是對DNA損傷的修復(fù)；以及在DNA復(fù)制時切除RNA引物并填補其留下的空隙。修復(fù)紫外光引起的DNA損傷DNA復(fù)制的主要聚合酶，還具有3’-5‘外切酶的校對功能，提高DNA復(fù)制的保真性真核生物中的DNA聚合酶

α

β

γ

δ

ε定位細(xì)胞核細(xì)胞核線粒體細(xì)胞核細(xì)胞核3‘-5’外切--+++酶活性功能引物合成修復(fù)作用線粒體DNA的復(fù)制核DNA的復(fù)制？

6、DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）：若雙鏈DNA中一條鏈有切口，一端是3’-OH，另一端是5‘-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。但是它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來

DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起重要作用3‘5‘3‘5‘OHP7、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNATopisomerase)：拓?fù)洚悩?gòu)酶?：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負(fù)超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

例：大腸桿菌中的ε蛋白拓?fù)洚悩?gòu)酶Π：該酶能暫時性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負(fù)超螺旋引入DNA分子。同復(fù)制有關(guān)。例：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶7、DNA解螺旋酶/解鏈酶（DNAhelicase)通過水解ATP獲得能量來解開雙鏈DNA。中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。rep蛋白沿3’5’移動，而解螺旋酶I、II、III沿5’

3’移動。9、單鏈結(jié)合蛋白(SSBP-single-strandbindingprotein)：穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈，阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈不被核酸酶降解。（三）DNA的復(fù)制過程（大腸桿菌為例）雙鏈的解開

RNA引物的合成

DNA鏈的延伸切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段1、雙鏈的解開

DNA的復(fù)制有特定的起始位點，叫做復(fù)制原點。ori(或o）、富含A、T的區(qū)段。基本概念：從復(fù)制原點到終點，組成一個復(fù)制單位，叫復(fù)制子復(fù)制時，解鏈酶等先將DNA的一段雙鏈解開，形成復(fù)制點，這個復(fù)制點的形狀象一個叉子，故稱為復(fù)制叉復(fù)制叉復(fù)制叉復(fù)制方向和速度：

單起點、雙向等速多起點、雙向等速雙鏈解開、復(fù)制起始大約20個DnaA蛋白在ATP的作用下與oriC處的4個9bp保守序列相結(jié)合2、RNA引物的合成DnaB蛋白活化引物合成酶，引發(fā)RNA引物的合成。引物長度約為幾個至10個核苷酸，DNA的半不連續(xù)復(fù)制（semi-discontinuousreplication)DNA復(fù)制時其中一條子鏈的合成是連續(xù)的，而另一條子鏈的合成是不連續(xù)的，故稱半不連續(xù)復(fù)制。在DNA復(fù)制時，合成方向與復(fù)制叉移動的方向一致并連續(xù)合成的鏈為前導(dǎo)鏈；合成方向與復(fù)制叉移動的方向相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈為滯后鏈。3、DNA鏈的延伸在DNA復(fù)制過程中，前導(dǎo)鏈能連續(xù)合成，而滯后鏈只能是斷續(xù)的合成53的多個短片段，這些不連續(xù)的小片段稱為岡崎片段。4、切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段（復(fù)制終止）在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填補上；在DNA連接酶作用下，連接相鄰的DNA鏈雙鏈環(huán)狀、θ型復(fù)制、雙向等速（五）真核生物中DNA的復(fù)制特點1、真核生物每條染色體上有多個復(fù)制起點，多復(fù)制子2、真核生物染色體在全部復(fù)制完之前,各個起始點不再重新開始DNA復(fù)制；而在快速生長的原核生物中，復(fù)制起點可以連續(xù)開始新的復(fù)制(多復(fù)制叉)。真核生物快速生長時，往往采用更多的復(fù)制起點。3、真核生物有多種DNA聚合酶。1復(fù)制概況a、多個復(fù)制子，雙向復(fù)制b、復(fù)制子相對較小(13-900kb),復(fù)制速度較慢，大約500~5000bp/min（3000bp/min）岡崎片段100～200bpc、復(fù)制終止通過復(fù)制叉的相遇而終止（五）真核生物中DNA的復(fù)制d.不同的發(fā)育時期，真核的復(fù)制起始點和復(fù)制子的大小會變化。有些復(fù)制起點在不同的發(fā)育階段就不再發(fā)揮作用。如果蠅受精后復(fù)制原點從五千個上升到五萬個。發(fā)育早期，每個復(fù)制子長7.9Kb，成體時，每個復(fù)制子長40Kb，很多Ori區(qū)不再起作用。真核生物DNA聚合酶及有關(guān)蛋白

表真核生物五種DNA聚合酶DNA聚合酶αδεβγ位置核核核核線粒體功能引發(fā)合成修復(fù)修復(fù)復(fù)制相對活性80%

10-15%2-15%分子量300K170-230K250K40K180-300K亞基催化核心（180K）兩個引物酶(60,50K)一個未知催化核心(125K)一個未知(25K)催化核心一個未知催化催化3’→5’外切-++-+雙脫氧T不影響不影響弱抑制抑制蚜黃素抑制抑制抑制不影響不影響

表真核復(fù)制需要的酶和蛋白蛋白亞基功能DNA聚合酶α/引發(fā)酶4引物合成DNA聚合酶δ2DNA合成PCNA1延伸（滑動鉗作用）復(fù)制因子RF-C

3延伸（載體作用）復(fù)制因子RF-A3單鏈結(jié)合拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和Ⅱ

維持DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)2

SV40復(fù)制

雙鏈環(huán)狀DNA，具有核小體，全長5243bp2.1復(fù)制起始區(qū)：具有2個位點位點2包括以下：10bp的前期區(qū)，27bp的T抗原結(jié)合位點，含GAGGC17bp的A-T豐富區(qū)。真核生物DNA復(fù)制叉結(jié)構(gòu)示意圖3酵母的自主復(fù)制區(qū)ARS(autonomouslyreplicatingsequence)序列，在酵母染色體復(fù)制和質(zhì)粒復(fù)制中均發(fā)揮復(fù)制起點的功能。A、B起主要作用，C區(qū)作用微弱。ARS1分為A,B,C三個功能區(qū)：A區(qū)：15bp，其中11個保守，稱ACS

：5′ATTTAT（T/C）TTTA3′有復(fù)制起始子的功能。B區(qū)：約80bp,含B1,B2,B3三個區(qū)。B3：ABF1（ARS-bindingfactor1）結(jié)合區(qū)ABF14真核生物DNA末端的復(fù)制

(1)端粒DNATTGGGG(T2G4)序列高度重復(fù)的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(富含G鏈)

3’AACCCCAACCCCAACCCC5’(富含C鏈)

（2）端粒酶：首先在四膜蟲中發(fā)現(xiàn)端粒酶：特殊的反轉(zhuǎn)錄酶，由蛋白質(zhì)和RNA組成。端粒酶以自身攜帶的150bp的RNA為模板，在隨從鏈模板DNA的3′OH末端延長DNA，再以這種延長的DNA為模板，繼續(xù)合成隨從鏈。Greider和Blackburn(1989)，1）端粒酶與端粒DNA結(jié)合，端粒酶中的RNA與凸出的3’引物配對；2）以RNA為模板，在3’端上從頭合成六個Nt；3）合成一個重