中藥軟肝飲對(duì)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠信號(hào)通路的影響3700字【摘要】[目的]研究中藥軟肝飲對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化肝臟TGF-1及Smad3，Smad7敘述的影響，探討其抗纖維化的作用機(jī)制。[辦法]Wistar大鼠40只，隨機(jī)分成正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，軟肝飲治療組，鱉甲軟肝片對(duì)照組，采用CCl4背部皮下注射構(gòu)建肝纖維化模型，行HE和VG染色，光鏡下察看肝組織肝纖維化程度。同時(shí)免疫組化SABC辦法檢測(cè)各組TGF-1、Smad3和Smad7的敘述。[結(jié)果]與正常對(duì)照組相比，模型組TGF-1、Smad3敘述明顯增強(qiáng)，Smad7敘述明顯下降。經(jīng)軟肝飲治療后大鼠肝臟TGF-1敘述比模型組減弱。軟肝飲同時(shí)下調(diào)Smad3的敘述，上調(diào)Smad7的敘述。另外，軟肝飲組大鼠肝臟病理變化顯著改善。[結(jié)論]肝炎平對(duì)大鼠肝纖維化肝臟TGF-1/Smad信號(hào)通路有明顯的影響，能抑制CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，其作用機(jī)制可能為抑制TGF-1敘述，下調(diào)Smad3及上調(diào)Smad7的敘述。

【關(guān)鍵詞】軟肝飲;TGF-1/Smad信號(hào)通路;肝纖維化

肝纖維化(hepaticfibrosis，HF)是多種原因引起的慢性肝損傷的共同病理改變，其特征是纖維增生和降解不平衡，纖維組織在肝臟過(guò)度沉積的結(jié)果[1]。研究證實(shí)，肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells，HSC)活化和轉(zhuǎn)型在肝纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，HSC的激活在HF發(fā)生、開(kāi)展中處于中心地位[2-3]。而TGF-b是促進(jìn)肝纖維化開(kāi)展的最重要的細(xì)胞因子之一,它可與肝星狀細(xì)胞外表的受體結(jié)合,通過(guò)激活Smad通路,從而促進(jìn)膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌[4]。Smad家族是TGF-b1細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的通道，有研究發(fā)現(xiàn)[5-6]TGFb-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肝纖維化的發(fā)生開(kāi)展中起著重要的作用，軟肝飲的抗纖維化作用亦可能與TGF-1/Smad信號(hào)通路有關(guān)，為了探討其抗肝纖維化作用的機(jī)制，我們采用CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，用免疫組化辦法檢測(cè)TGF-1、Smad3、Smad7的敘述，察看軟肝飲對(duì)肝纖維化時(shí)肝臟TGF-1/Smad信號(hào)通路的影響。

1材料和辦法

1.1材料

動(dòng)物：同一品系清潔級(jí)健康Wistar大鼠40只，雄性，質(zhì)量(130～150g)及普通飼料均由安徽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。藥品和主要試劑：(1)軟肝方(組成:鱉甲50g、黃芪50g、柴胡25g、丹參50g、川芎34g、莪術(shù)34g)由本院藥劑科提供，臨用前用雙蒸水稀釋成不同濃度備用。(2)CCl4，購(gòu)自南京建成生物有限公司(批號(hào)：10006418)。(3)鱉甲軟肝片由內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：20221106)，研制成粉末，雙蒸水溶解成含藥1ml/100g(0.6g/kg)混懸液。(4)TGF-1、Smad3、Smad7免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物項(xiàng)目有限公司。(5)花生油，購(gòu)自超市。

2辦法

2.2.1分組

將40只Wistar大鼠(雄性、體重量130～150g)隨機(jī)分成4組:正常對(duì)照組10只,CCl4肝纖維化模型組10只，軟肝飲治療組10只，陽(yáng)性(鱉甲軟肝片)對(duì)照組10只。

2.2.2動(dòng)物模型制備

將CCl4與高壓滅菌花生油按1：9比例配成10%油劑，第1～4周，除正常組外，其他各組大鼠按0.5ml/100g背部皮下注射10%CCl4花生油溶液，每周兩次。5～13周，正常組和CCl4肝纖維化模型組給予生理鹽水，軟肝飲組大鼠每天給予軟肝飲灌胃1次,劑量為2.0g/kg大鼠體重(相當(dāng)于臨床用藥量的16倍)。陽(yáng)性對(duì)照組每天給與鱉甲軟肝片1ml/100g(0.6g/kg)灌胃1次。各組動(dòng)物每周稱(chēng)重一次，根據(jù)體重變化調(diào)整給藥量。第13周末，末次給藥24h后，全部大鼠股動(dòng)脈放血處死,留取血液及全部肝臟,每只大鼠取相同部位肝臟用10%中性甲醛固定,殘余-80°C低溫冰箱保留;血液1500rpm離心后取血清置于-80°C低溫冰箱保留。

2.3免疫組化半定量判斷指標(biāo)

光鏡下察看肝臟病理變化并參照王寶恩等[7]肝纖維化分級(jí)法進(jìn)行膠原纖維增生程度半定量分析。免疫組化SABC(即鏈酶親和素-生物素-酶復(fù)合物Strept-Avidin-Biotin-Complex)法檢測(cè)TGF-1、Smad3、Smad7，結(jié)果判定:采用Bresalier[8]半定量公式稍加修改判斷染色結(jié)果。切片在10倍物鏡視野下察看，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野中各染色強(qiáng)度細(xì)胞數(shù)的百分比。根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度分為四級(jí)，并分別計(jì)分;陰性，細(xì)胞無(wú)著色(0分);弱陽(yáng)性，細(xì)胞著色為淺黃色(1分);中度陽(yáng)性，細(xì)胞著色為棕黃色(2分);強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞著色為棕褐色(3分)，計(jì)算每一強(qiáng)度的視野數(shù)，根據(jù)以下公式計(jì)算每張切片的平均染色強(qiáng)度:IS(intensityscore)=∑{(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)｝，F(xiàn)i=%10×視野數(shù)(i=0，1，2，3)。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS11.0軟件包統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以mean±SD表示，方差齊用多組間均數(shù)兩兩比擬用單因素方差分析，LSD法，方差不齊用秩和檢驗(yàn)，多樣本兩兩比擬用Nemenyi法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，雙側(cè)a=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

3結(jié)果

3.1病理組織學(xué)改變

正常組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，結(jié)構(gòu)正常。模型組肝組織病理?yè)p害嚴(yán)重，正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞明顯腫脹變性，其中多為脂肪變性，肝小葉中央?yún)^(qū)明顯壞死。間質(zhì)內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原增生顯著，增生結(jié)締組織分割肝小葉，接近形成假小葉。軟肝飲治療組與模型組相比，肝組織結(jié)構(gòu)破壞不明顯，肝細(xì)胞脂肪變性程度顯著減輕，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞壞死減輕，少見(jiàn)纖維結(jié)締組織增生(圖1A，B)。

3.2免疫組化結(jié)果

TGF-1在正常組肝組織肝竇處有陽(yáng)性著色，與正常組比擬模型組TGF-1敘述明顯增強(qiáng)(P3.3各組大鼠肝組織Smad3和Smad7的敘述

正常對(duì)照組肝組織可見(jiàn)少量Smad3弱陽(yáng)性敘述，主要分布于血管壁;模型組Smad3強(qiáng)陽(yáng)性敘述細(xì)胞數(shù)明顯增多，主要分布于纖維化匯管區(qū)及纖維間隔里的梭型細(xì)胞間質(zhì)和局部肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì);各治療組肝組織中僅梭型細(xì)胞間質(zhì)的Smad3呈中度陽(yáng)性敘述(圖3A)。其中模型組陽(yáng)性敘述細(xì)胞的平均染色強(qiáng)度積清楚顯高于各治療組(圖3B)，二者比擬均，P0.05二者無(wú)顯著性差別。Smad7在正常對(duì)照組大鼠肝臟組織僅少量陽(yáng)性敘述;模型組肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈弱陽(yáng)性敘述(圖4A)，各治療組大鼠肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞廣泛敘述Smad7(圖4B)。其中模型組Smad7陽(yáng)性敘述細(xì)胞平均染色強(qiáng)度積清楚顯低于各治療組，分別比擬二者均P0.05無(wú)顯著性差別(表1)。表1大鼠肝組織TGF-1，Smad3，Smad7的敘述(略)

4討論

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1(TGF-1)是影響活化肝星狀細(xì)胞(HSC)、促進(jìn)膠原等細(xì)胞外基質(zhì)合成，加劇纖維化形成的主要生物因子，活化后的TGF-1結(jié)合于特異性受體后進(jìn)入信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)揮其生物學(xué)作用。迄今為止，Smad蛋白是TGF-1受體胞內(nèi)激酶的唯一底物，它既是胞內(nèi)信號(hào)分子，又有轉(zhuǎn)錄激活作用。Smad蛋白家族中的Smad3與Smad7是TGFb受體后信息分子，參與調(diào)控細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)化、合成、分泌和凋亡。其中Smad3是HSC活化的重要媒介，而Smad7是TGFb信號(hào)的拮抗因子[9]。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣虛血滯為肝纖維化之本，濕毒熱邪稽留血分為標(biāo)，肝無(wú)血養(yǎng)而失柔，治那么要以活血益氣、養(yǎng)血柔肝為根底，如余邪未清，佐以祛邪。軟肝飲主要由黃芪、丹參、莪術(shù)、鱉甲、柴胡等多味中藥組成，具有活血化瘀、益氣散結(jié)、疏肝利膽的成效，正是針對(duì)肝纖維化的病理環(huán)節(jié)組方。本結(jié)果顯示，軟肝飲治療組肝纖維化程度較模型組明顯減輕，軟肝飲能夠顯著抑制TGF-1，拮抗胞內(nèi)關(guān)鍵信