探討P.g及致病島rag基因在正畸牙齦炎性反應(yīng)中的作用,口腔科學(xué)論文正畸治療中牙齦炎性反響是固定矯治經(jīng)過中的常見并發(fā)癥，牙齦炎癥的發(fā)生與眾多因素有關(guān)，牙周致病菌是重要因素之一。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.g)是當(dāng)前公認(rèn)的慢性牙周炎的主要致病菌之一，能分泌大量的毒力因子，導(dǎo)致牙周組織毀壞，在牙周病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。致病島的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)細(xì)菌致病性有更深的認(rèn)識(shí)。當(dāng)前rag位點(diǎn)被確定為P.g的致病島基因之一，研究證實(shí)，rag位點(diǎn)失活會(huì)使P.g的致病性降低，對(duì)牙周組織的毀壞減少。rag位點(diǎn)在臨床菌株中有4種基因型，分別命名為rag-1、rag-2、rag-3和rag-4，不同基因型的致病能力亦不同。本研究采用16SrDNAPCＲ和多重PCＲ對(duì)P.g及致病島rag基因進(jìn)行檢測(cè)，分析其與臨床指標(biāo)的關(guān)系，討論P(yáng).g及致病島rag基因在正畸牙齦炎性反響中的作用。資料和方式方法1.材料牙齦卟啉單胞菌P.g(ATCC33277)、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum，F(xiàn).n)(ATCC25586)和伴放線放線桿菌(Aggregatibacteractinomycetemcomitans，A.a)(ATCC29522)(購自四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院);牙齦卟啉單胞菌(W83)(購自北京口腔醫(yī)院);細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。2.臨床資料選取102名受試者(濟(jì)南市口腔醫(yī)院正畸科和口腔內(nèi)科)。所有受試者3個(gè)月內(nèi)未接受系統(tǒng)牙周治療，未服用抗生素和引起牙齦增生的藥物。牙周檢查:對(duì)全口牙牙齦指數(shù)(Gingivitisindex，GI)、探診深度(probingdepth，PD)進(jìn)行普查，選臨床異常感覺和狀態(tài)最重的1顆牙為受試牙記錄指數(shù)。根據(jù)LoeH和Silness1967年修定的標(biāo)準(zhǔn)，分別記錄受試牙牙齦近中、遠(yuǎn)中、頰側(cè)、舌側(cè)4個(gè)區(qū)域的牙周情況，以4個(gè)牙面記分的平均值記錄為牙齦指數(shù)。GI分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為:0為牙齦正常;1為牙齦輕度炎癥，輕度顏色改變、輕度水腫、探診不出血;2為牙齦中度炎癥，顏色發(fā)紅，水腫光亮、探診出血;3為牙齦重度炎癥;明顯發(fā)紅和水腫、或有潰瘍、有自發(fā)出血傾向。由統(tǒng)一受過訓(xùn)練的醫(yī)師對(duì)受試者進(jìn)行臨床檢查和標(biāo)本收集。納入標(biāo)準(zhǔn):正畸牙齦炎組:戴入矯治器后產(chǎn)生牙齦炎性反響者(GI1，PD3mm)57例，男19例，女38例，年齡10～30歲，平均16.30歲;對(duì)照組:戴矯治器前牙周健康者(GI=0，PD＜3mm)20例，男8例，女12例，年齡10～30歲，平均16.05歲;牙周炎組:牙周科確診的牙周炎患者(GI1，PD＞4mm)25例，男性15例，女性10例，年齡20～60歲，平均40.36歲。3.實(shí)驗(yàn)方式方法由統(tǒng)一培訓(xùn)過的醫(yī)師對(duì)患者進(jìn)行牙周檢查;采用無菌紙尖法采集患者牙周袋或齦溝中的齦溝液。標(biāo)本采集選患者炎癥最嚴(yán)重的患牙，取其牙周探診最深部位;常規(guī)清水漱口，生理鹽水沖洗，去除食物殘?jiān)耷蚋魸?，吹干，將無菌紙尖插入牙周袋或齦溝有阻力時(shí)停止，停留30s取出，放入1ml磷酸鹽緩沖液的EP管內(nèi)，-20℃保存待測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)菌株及齦溝液DNA提取:標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA提取采用DNA提取試劑盒;臨床標(biāo)本DNA提取采用加熱裂解法。引物設(shè)計(jì)及合成:P.g16SrDNA及4種rag基因型特異性引物序列的設(shè)計(jì)(表1)。PCＲ擴(kuò)增:16SrDNAPCＲ反響體系為PCＲ混合液12.5L，模板DNA為標(biāo)準(zhǔn)株1.0L(100ng/L)，臨床標(biāo)本5.0L，引物各1.0L(10M)，用無菌雙蒸水補(bǔ)充至總體積25L。多重PCＲ反響體系:10倍反響緩沖液2.5L，TaqDNA聚合酶0.5L，dNTPs0.5L，模板DNA5.0L，引物2.0L(將未經(jīng)稀釋的5對(duì)引物的原始液混合稀釋后的引物作為應(yīng)用液，計(jì)作引物A，將4種rag基因型的引物混合稀釋后的引物計(jì)作引物B)，用無菌雙蒸水補(bǔ)充至總體積25L。PCＲ循環(huán)條件:94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min(30個(gè)循環(huán));72℃延伸10min。16SrDNAPCＲ與多重PCＲ對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株的檢測(cè):以16SrDNA引物擴(kuò)增P.g2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC33277和W83)，以F.n和A.a為陰性對(duì)照，以無菌雙蒸水為空白對(duì)照，檢測(cè)引物對(duì)P.g的特異性和敏感性。分別以16SrDNA、混合引物A、混合引物B為引物，以P.gATCC33277的DNA為模板，進(jìn)行多重PCＲ擴(kuò)增，檢測(cè)多重PCＲ的敏感性及引物的特異性。16SrDNAPCＲ及多重PCＲ對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè):以16SrDNA為引物，以臨床標(biāo)本DNA為模板，對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，確定P.g陽性患者;以P.g陽性患者DNA為模板，以混合引物B為引物進(jìn)行多重PCＲ擴(kuò)增，確定致病島rag基因的分布情況。PCＲ擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè):取擴(kuò)增產(chǎn)物，用1TAE電泳緩沖液，1.5%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5mg/L溴化乙錠)，電泳條件為電壓90V，時(shí)間15～20min，凝膠成像分析。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間P.g及致病島rag基因檢出率的差異用2檢驗(yàn);P.g及致病島rag基因檢出率與患者年齡及臨床指數(shù)的差異用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn);細(xì)菌檢出率與各級(jí)臨床指標(biāo)之間的關(guān)系用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。結(jié)果1.16SrDNAPCＲ與多重PCＲ對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株的檢測(cè)結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可見，應(yīng)用16SrDNAPCＲ技術(shù)，P.gATCC33277和P.gW83菌株DNA均擴(kuò)增出404bp的目的條帶，而陰性對(duì)照A.a和F.n及空白對(duì)照未見目的條帶，講明該引物具有擴(kuò)增P.g的特異性，該反響體系具有檢測(cè)P.g的敏感性(圖1)。應(yīng)用多重PCＲ技術(shù)，以P.g菌株DNA為模板，16SrDNA引物擴(kuò)增出404bp目的條帶，引物B擴(kuò)增出739bp目的條帶，引物A擴(kuò)增出404bp和739bp目的條帶;講明多重PCＲ反響體系具有擴(kuò)增P.g及致病島rag基因的特異性和敏感性(圖2)。2.臨床指標(biāo)檢查結(jié)果牙齦指數(shù)結(jié)果:正畸牙齦炎組0級(jí):16例，1級(jí)20例，2級(jí)21例;對(duì)照組均為0級(jí)20例;牙周炎組0級(jí)10例，1級(jí)15例。探診深度結(jié)果:正畸牙齦炎組(57例)平均探診深度為4.1371.087mm，對(duì)照組(20例)為1.8820.235mm，牙周炎組(25例)為5.6880.459mm。牙周炎組高于正畸牙齦炎組，兩者均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。3.16SrDNAPCＲ及多重PCＲ對(duì)臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果以16SrDNA引物PCＲ擴(kuò)增102例受試者臨床標(biāo)本，檢出P.g情況見表2;正畸牙齦炎組明顯高于對(duì)照組，牙周炎組高于正畸牙齦炎組和對(duì)照組，三者之間有顯著性差異(2=15.918，P＜0.001)。PCＲ對(duì)正畸牙齦炎患者臨床標(biāo)本P.g檢測(cè)結(jié)果見圖3，a為標(biāo)準(zhǔn)P.g菌株陽性對(duì)照;b為空白對(duì)照;c～n為臨床標(biāo)本，華而不實(shí)除c、h外，均擴(kuò)增出404bp目的條帶。以pn為引物PCＲ擴(kuò)增65例P.g陽性患者臨床標(biāo)本，擴(kuò)增出致病島rag基因的有52例，結(jié)果見表2。正畸牙齦炎組明顯高于對(duì)照組，牙周炎組高于正畸牙齦炎組和對(duì)照組，三者之間有顯著性差異(2=30.630，P＜0.001)。多重PCＲ對(duì)正畸牙齦炎患者臨床標(biāo)本中致病島rag基因的檢測(cè)結(jié)果見圖4，臨床標(biāo)本a、b均擴(kuò)增出628bp目的條帶，c擴(kuò)增出979bp目的條帶，d擴(kuò)增出628bp和739bp目的條帶，f擴(kuò)增出739bp目的條帶，e擴(kuò)增出423bp目的條帶，g未見目的條帶。4.P.g及致病島rag基因檢出率與GI之間的關(guān)系用Spearman等級(jí)相關(guān)分析P.g及致病島rag基因檢出率均與牙齦指數(shù)GI之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。65例PCＲ擴(kuò)增陽性的患者平均年齡為25.54歲，而陰性的患者年齡平均為16.19歲，二者具有明顯差異(t=3.922，P＜0.001)(表3)。討論固定矯治是矯治錯(cuò)頜畸形的主要方式方法，但由于矯治裝置的參加，使口腔微生態(tài)環(huán)境發(fā)生很大的變化，原有的微生態(tài)平衡狀態(tài)被毀壞，進(jìn)而對(duì)口內(nèi)定居的微生物產(chǎn)生影響，導(dǎo)致牙齦組織的炎癥。P.g是革蘭陰性專性厭氧菌，具有一系列逃避宿主防御機(jī)制及毀壞宿主組織的毒性因子，如菌毛、多糖夾膜、脂多糖、外膜膜泡和多種蛋白酶，是當(dāng)前公認(rèn)的慢性牙周炎的重要病原菌，與牙周炎癥的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。本研究中的正畸牙齦炎組均為戴入矯治器之后產(chǎn)生牙齦炎性反響的患者，表現(xiàn)為牙齦肥大或增生，其平均年齡16.30歲，P.g的檢出率為61.40%;作為對(duì)照組的為未帶矯治器正畸治療前的牙周健康者，其平均年齡為16.01歲，P.g的檢出率為35.00%;而牙周炎組炎癥最為嚴(yán)重，陽性率為92.00%，三者間有顯著性差異。正畸牙齦炎組與對(duì)照組年齡相仿，但檢出率卻有明顯差異，而且以Spearman等級(jí)相關(guān)分析正畸牙齦炎組P.g的檢出率與GI呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，提示牙齦卟啉單胞菌不僅僅是慢性牙周炎的主要致病菌，對(duì)正畸矯治經(jīng)過中產(chǎn)生的牙齦炎性反響也有重要作用。65例PCＲ擴(kuò)增P.g陽性的患者平均年齡為25.54歲，而P.g陰性的患者年齡平均為16.19歲，二者具有明顯差異，提示P.g的檢出率可能隨患者年齡的增加而增高。病原菌致病是一個(gè)多因素共同作用的結(jié)果，P.g基因的多態(tài)性和復(fù)雜性使得其致病機(jī)制迄今尚不明了，致病島的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)細(xì)菌致病性有了更深的認(rèn)識(shí)。致病島又稱毒力島，是伴隨腸道致病菌的研究逐步被揭示的，致病島是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量較大的片段，用于編碼細(xì)菌毒力基因簇，是整合于細(xì)菌基因DNA組的外源性成分，揣測(cè)其可能來自于細(xì)菌進(jìn)化經(jīng)過中DNA的基因水平轉(zhuǎn)移事件。一種病原菌經(jīng)常同時(shí)具有1個(gè)或幾個(gè)致病島，致病島一般存在于強(qiáng)毒株中，弱毒株或無毒株經(jīng)常缺失。當(dāng)前，rag位點(diǎn)被確定是P.gingivalis的致病島基因之一。rag位點(diǎn)主要含有基因ragA和ragB，分別編碼ＲagA和ＲagB蛋白。ＲagA是TonB類受體外膜蛋白;而ＲagB是一種外表抗原，Ｒag蛋白構(gòu)成膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，協(xié)助細(xì)菌從外部環(huán)境獲取轉(zhuǎn)運(yùn)大分子，利于細(xì)菌的存活和散播;同時(shí)Ｒag蛋白還能夠激活宿主的免疫及炎癥反響。Curtis等用PCＲ技術(shù)分析ragB在齦下菌斑的分布，發(fā)現(xiàn)rag+的牙齦卟啉單胞菌在深牙周袋比在淺牙周袋位點(diǎn)更易檢測(cè)到。研究講明rag基因可能影響牙齦卟啉單胞菌的潛在毒力。rag位點(diǎn)在臨床菌株中有4種基因型，分別命名為rag-1、rag-2、rag-3和rag-4。在對(duì)四中rag基因型的比擬中發(fā)現(xiàn)，它們的基因及氨基酸序列存在較大差異，這可能與基因轉(zhuǎn)移及重組的經(jīng)過中發(fā)生的大片段基因的獲得和缺失進(jìn)而產(chǎn)生的突變有關(guān)，四種ＲagB蛋白均為一種免疫抗原，它能夠與宿主產(chǎn)生IgG免疫反響，但是它們相互之間在構(gòu)造及功能上的差異當(dāng)前還沒有實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究采用多重PCＲ技術(shù)對(duì)臨床標(biāo)本中4種rag基因進(jìn)行檢測(cè)，所建立的多重PCＲ技術(shù)具有較高的敏