生化基礎(chǔ)知識介紹主要內(nèi)容：生化儀發(fā)展分析方法介紹幾個名詞臨床意義生化分析儀的發(fā)展史：

1957年Technicon公司(AutoAnalyzer)，單通道連續(xù)流動式，模仿手工。

60年代后隨電子計算機技術(shù)迅速發(fā)展。生化自動分析在中國的發(fā)展分期

分期年代主要特征認識時期1972-1980引進了三臺連續(xù)流動式生化分析儀，開始研制生化分析儀從認識到應(yīng)用─自動化的最初階段1980-19841、引進半自動、全自動生化分析儀約8種型號共幾十套。2、第一個中外（美）合作實驗室建立，引進一批自動化儀器和配套Kits，開展了室內(nèi)質(zhì)控。3、開始研制KIT。4、開展了室間質(zhì)量調(diào)查→EQA。迅速發(fā)展時期1984-19901、自動分析儀被廣泛認識，自動化程度高，質(zhì)量好的儀器進入中國，半自動推廣較快，型號達20多種近2000套。2、與自動分析儀配套的KIT商品化被廣泛接受，酶法分析有較大推廣。KIT已從研究步入工業(yè)生產(chǎn)。3、出現(xiàn)第二個中外（日）合作自動化程度較高的實驗室。自動化分析儀質(zhì)量越來越高，高速度智能化1990-19961、全自動推廣。與國際差距縮小。2、Kits國產(chǎn)和中外合作生產(chǎn)的已占有優(yōu)勢，先進的方法學(xué)得到更大普及，13種落后方法被法令淘汰。3、少數(shù)大醫(yī)院開始建立初級的LIS。向可靠而高效的方向發(fā)展，TAL在中國開始出現(xiàn)1996-1、LIS應(yīng)用增多。2、分析前自動化系統(tǒng)引進。3、初級TAL出現(xiàn)。4、IQC，EQA在全國普遍有效開展。遠程EQA系統(tǒng)啟用。分期年代主要特征全自動生化分析儀臨床應(yīng)用規(guī)范化2001年以來1.與國外同步，國產(chǎn)化。2.流水線逐漸推廣普及。3.2004年發(fā)布《自動生化分析儀應(yīng)用規(guī)范》。4.準確性溯源和檢測系統(tǒng)的概念增強。

生化儀的分類

☆按反應(yīng)裝置結(jié)構(gòu)：連續(xù)流動式、離心式和分立式。

☆按同時檢測項目與否：單通道、多通道。

☆按儀器的自動化程度：全自動、半自動。

☆按儀器復(fù)雜程度：小型、中型和大型。

（一）連續(xù)流動式分析儀

特點：同一管道中進行一個接一個速度慢(二)離心式生化分析儀特點：圓盤內(nèi),

離心力混合，高速旋轉(zhuǎn)中比色。

（三）、分立式分析儀

特點：在不同反應(yīng)杯中進行，不同的加樣器自動加樣，依次檢測可有多個加樣臂，速度快。10前分光和后分光方式

光柵分光有前分光和后分光兩種方式，光源首先經(jīng)過單色器分光，然后透射到比色溶液的方式為前分光。目前以后分光方式為多見，其優(yōu)點是單色器中沒有轉(zhuǎn)動部分，雙波長在同一時刻檢測，因而提高了檢測的精度和速度。11

光源先透過比色杯中的反應(yīng)液再照射到光柵上，經(jīng)色散后所有固定單色光同時通過各自的光纖傳輸?shù)綄?yīng)的檢測器，微處理器按該分析項目的分析參數(shù)，后分光方式選擇其中一個或兩個波長（雙波長方式）的吸光度值，用于分析結(jié)果的計算。12分析方法分類

（一）終點法（endassay）

被測物質(zhì)在反應(yīng)過程中完全被轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，到達反應(yīng)終點，根據(jù)終點吸光度的大小求出被測物濃度，稱為終點法。該法稱為平衡法更為恰當(dāng)。從時間-吸光度曲線來看，到達反應(yīng)終點或平衡點時，吸光度將不再變化。終點法參數(shù)設(shè)置簡單，反應(yīng)時間一般較長，精密度較好。

13終點時間的確定①根據(jù)時間-吸光度曲線來確定，②根據(jù)被測物反應(yīng)終點，結(jié)合干擾物的反應(yīng)情況來確定。14一點終點法（onepointendassay）

在反應(yīng)到達終點，即在時間-吸光度曲線上吸光度不再改變時選擇一個終點吸光度值，用于計算結(jié)果。結(jié)果計算公式：待測物濃度CU=（待測吸光度AU－試劑空白吸光度AB）×KK為校準系數(shù)

15一點終點法反應(yīng)曲線

A單試劑一點終點法B雙試劑一點終點法16兩點終點法（twopointendassay）

在被測物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開始時，選擇第一個吸光度，在反應(yīng)到達終點或平衡時選擇第二個吸光度，此兩點吸光度之差用于計算結(jié)果。計算公式為：CU=（待測吸光度A2－待測吸光度A1）×K。17

兩點終點法反應(yīng)曲線

A單試劑兩點終點法B雙試劑兩點終點法

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該法能有效地消除溶血(hemolysis)、黃疸（icterus）和脂濁（lipo-turbid）等樣品本身光吸收造成的干擾。血紅蛋白、膽紅素和脂濁的

光吸收曲線

19（二）固定時間法（fixed-timeassay）

指在時間-吸光度曲線上選擇兩個測光點，此兩點既非反應(yīng)初始吸光度亦非終點吸光度，這兩點的吸光度差值用于結(jié)果計算。有時也稱此法為兩點法。計算公式與兩點終點法相同，CU=(A2-A1)×K。20固定時間法反應(yīng)曲線

A單試劑固定時間法B雙試劑固定時間法該分析方法有助于解決某些反應(yīng)的非特異性問題。

21連續(xù)監(jiān)測法

（continuousmonitoringassay）又稱速率法（rateassay），是在測定酶活性或用酶法測定代謝產(chǎn)物時，連續(xù)選取時間-吸光度曲線中線性期（各兩點間吸光度差值相等）的吸光度值，并以此線性期的單位吸光度變化值（ΔA/min）計算結(jié)果。22連續(xù)監(jiān)測法反應(yīng)曲線

A單試劑連續(xù)監(jiān)測法

B雙試劑連續(xù)監(jiān)測法

23酶促反應(yīng)的線性段

δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1點至A4點屬線性段24連續(xù)監(jiān)測法的優(yōu)點可以確定線性期并計算ΔA/min，根據(jù)此值再準確地計算酶活性，因而使自動生化分析儀在酶活性測定方面顯著地優(yōu)于手工法。連續(xù)監(jiān)測法也可用于測定呈線性反應(yīng)的代謝物濃度，一般是某些基于酶法測定的代謝物。酶活性（U/L）＝ΔA/min×理論（或校準）K值。代謝物濃度CU=ΔA/min×校準K值。25理論K值

多用于酶活性測定中，因酶活性尚無公認的校準品可用。根據(jù)酶活性的國際單位定義得出酶活性的計算公式為：酶活性(U/L)=ΔA/min×將此式中以K來表示，即為理論K值可作為分析參數(shù)輸入到分析儀中。

26采用理論K值的前提

應(yīng)當(dāng)是樣品和試劑的加量準確、比色杯光徑準確、溫度控制精確以及波長準確等。但事實上由于各型分析儀在注射器容積步進電機精度、濾光片帶寬等方面的差異，可造成樣品和試劑加量以及吸光度檢測的偏差，溫度的影響有時也非常大。27實際摩爾吸光系數(shù)和K值測定

由于摩爾吸光系數(shù)受比色杯光徑、波長等的影響，書本上或試劑廠家提供的理論摩爾吸光系數(shù)可能與實際所用分析儀所測的不同，因而有必要獲得實際的摩爾吸光系數(shù)，然后來計算理論K值。28NADH（NADPH）

摩爾吸光系數(shù)的測定NADH（NADPH）沒有標(biāo)準純制品，而且配成溶液后穩(wěn)定性又較差，不能直接用NADH或NADPH標(biāo)準液來校正儀器，須通過有NAD+(NADP+)參與的反應(yīng)途徑。29用已糖激酶(HK)或葡萄糖脫氫酶(GD)方法測定葡萄糖時，葡萄糖的消耗與NADH的生成呈等摩爾關(guān)系。葡萄糖有標(biāo)準純制品。根據(jù)公式A=εbC，已知比色杯光徑b和葡萄糖標(biāo)準液濃度，測得葡萄糖標(biāo)準管的吸光度A后便可計算出NADH（NADPH）的摩爾吸光系數(shù)ε為A/bC。30測定方法

葡萄糖標(biāo)準液濃度為1Ommo1/L(0.01mol/L)，標(biāo)準液加入量為3.5μL，酶試劑加入量為335μL，比色杯光徑為0.7cm，在340nm測得吸光度為0.465，則實測NADH摩爾吸光系數(shù)=＝6424，即在此臺分析儀上340nm波長處測得NADH（NADPH）的摩爾吸光系數(shù)為6424，而理論上NADH（NADPH）的ε為6220。31校準K值

酶活性校準品經(jīng)校準操作后由分析儀自動計算得出。在進行酶學(xué)測定時，如果分析條件的變化如溫度、樣品試劑加量和吸光度檢測偏差可同等程度地影響校準物和待測樣品，則使用校準品能進行補償。一般來說以使用校準K值為好，但必須有兩個先決條件：①必須使用配套的試劑；②必須使用配套的高質(zhì)量的校準品，該校準品應(yīng)具有溯源性。

32（四）透射比濁法

抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合形成的免疫復(fù)合物，在反應(yīng)液中具有一定的濁度，可由一般分光光度法進行透射比濁（transmissionturbidimetry）測定，可用于某些蛋白質(zhì)和藥物濃度等的測定。該法須做多點校準，再經(jīng)非線性回歸，求出抗原或抗體的含量。33常用生化檢測項目分析方法舉例

1．終點法檢測

常用的有總膽紅素（氧化法或重氮法）、結(jié)合膽紅素（氧化法或重氮法）、血清總蛋白（雙縮脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、總膽汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、總膽固醇（膽固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白膽固醇（直接測定法）、鈣（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、鎂（二甲苯胺藍法）等。342．固定時間法

苦味酸法測定肌酐采用此法。353．連續(xù)監(jiān)測法

對于酶活性測定一般應(yīng)選用連續(xù)監(jiān)測法，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、γ谷氨氨酰基轉(zhuǎn)移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代謝物酶法測定的項目如：脲酶偶聯(lián)法測定尿素等，也可用連續(xù)監(jiān)測法。364．透射比濁法

透射比濁法可用于測定產(chǎn)生濁度反應(yīng)的項目，多數(shù)屬免疫比濁法，載脂蛋白、免疫球蛋白、補體、抗“O”、類風(fēng)濕因子，以及血清中的其他蛋白質(zhì)如前白蛋白、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等均可用此法。37單波長和雙波長方式

（一）概念

采用一個波長檢測物質(zhì)的光吸收強度的方式稱為單波長方式。當(dāng)反應(yīng)液中含有一種組分，或在混合反應(yīng)液中待測組分的吸收峰與其它共存物質(zhì)的吸收波長無重疊時，可以選用。使用一個主波長和一個次波長的稱雙波長方式。當(dāng)反應(yīng)液中存在干擾物的較大吸收、從而影響測定結(jié)果的準確性時，采用雙波長方式更好。38（二）雙波長的作用①消除噪音干擾;②減少雜散光影響;③減少樣品本身光吸收的干擾：當(dāng)樣品中存在非化學(xué)反應(yīng)的干擾物如甘油三酯、血紅蛋白、膽紅素等時，會產(chǎn)生非特異性的光吸收，雙波長方式可以部分消除這類光吸收干擾。39（三）次波長的確定方法

當(dāng)被測物的主波長確定之后，根據(jù)干擾物吸收光譜特征選擇次波長，使干擾物在主、次波長處有盡可能相同的光吸收值，而被測物在主、次波長處的光吸收值應(yīng)有較大的差異。一般來說，次波長應(yīng)大于主波長100nm。以主波長與次波長吸光度差來計算結(jié)果。40單試劑和雙試劑方式

反應(yīng)過程中只加一次試劑稱單試劑方式，加兩次試劑便為雙試劑方式。雙試劑方式分析的優(yōu)點是：①可提高試劑的保存穩(wěn)定性；②能設(shè)置兩點終點法；③在某些項目檢測時能消除非特異性化學(xué)反應(yīng)干擾。41雙試劑方式消除非特異性化學(xué)

反應(yīng)干擾舉例血清ALT測定時，血清中原有酮酸也可與試劑LDH起反應(yīng)，使結(jié)果偏高。若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一試劑，使原有酮酸與LDH反應(yīng)，之后加入含有α-酮戊二酸的第二試劑，啟動ALT酶促反應(yīng)生成丙酮酸，這些丙酮酸與LDH反應(yīng)消耗的NAD＋能真正反映ALT活性，從而消除以上副反應(yīng)的影響。

42底物消耗的監(jiān)測

在連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性時，如果在監(jiān)測期內(nèi)吸光度上升或下降超過其底物耗盡值，則說明該樣品酶活性非常高，底物將被耗盡，監(jiān)測期的吸光度將偏離線性，使測定結(jié)果不可靠。此監(jiān)測對于采用負反應(yīng)分析酶活性的方法甚為重要。43

底物消耗監(jiān)測

44校準

分析儀在樣品分析之前要對該分析項目進行校準（也稱定標(biāo)），得出一個該項目的校準系數(shù)（K）。校準前首先必須在反應(yīng)程序里設(shè)定有關(guān)校準的參數(shù)，如校準液的代碼、位置及濃度值等。執(zhí)行校準程序，檢測得到該校準品的吸光度值，再根據(jù)校準濃度計算校準系數(shù)（K=校準品濃度/校準品吸光度）。

45校準方式

有單點校準、兩點校準和多點校準單點校準：校準曲線呈直線且通過原點，用單個濃度的校準液即可兩點校準：若校準曲線呈直線但不通過原點，則需用兩個濃度的校準液做兩點校準；多點校準：當(dāng)校準曲線不呈直線而為真正的曲線時，應(yīng)做多點校準，并按其線形選擇不同的曲線方程進行擬和，如雙曲線、拋物線、冪函數(shù)、指數(shù)函數(shù)、對數(shù)函數(shù)等方程等。46對校準的要求

（1）選擇合適（配套）的校準品（2）如有可能校準品應(yīng)溯源到參考方法或參考物質(zhì)。（3）確定校準的頻度。（4）如有下列情況發(fā)生時，必須進行校準：①改變試劑的種類或批號；②儀器或者檢驗系統(tǒng)進行一次大的預(yù)防性維護或者更換了重要部件；③質(zhì)控反映出異常的趨勢或偏移，或者超出了實驗室規(guī)定的接受限。47質(zhì)控品測定

質(zhì)控是保證檢測結(jié)果可靠性的一個重要手段，因此每批樣品的分析測定均應(yīng)該有質(zhì)控樣品同時監(jiān)測。關(guān)于分析儀的批測定，是指一批樣品從開始測定到完成測定后停止的整個過程。其中如果進行了添加或更新試劑、進行了有可能改變吸光度的維護等操作，均應(yīng)進行一次質(zhì)控樣品的檢測，以便及時監(jiān)測到分析系統(tǒng)的改變。48

所有分析儀都已設(shè)定或固化了有關(guān)質(zhì)控的分析程序①設(shè)定有關(guān)質(zhì)控參數(shù)，如每個質(zhì)控品的批號、靶值和標(biāo)準差；②選擇質(zhì)控圖的方式，如均值－標(biāo)準差質(zhì)控圖；③質(zhì)控結(jié)果的統(tǒng)計分析，分析儀會保存每次測定的質(zhì)控結(jié)果，并對其進行統(tǒng)計，以列表及質(zhì)控圖的形式在屏幕上顯示。

可根據(jù)質(zhì)控結(jié)果在質(zhì)控圖上的位置判斷其是否在控。如果判為失控則應(yīng)從試劑、質(zhì)控品、校準品和分析儀等幾方面尋找原因。通過對質(zhì)控結(jié)果的分析，可以了解某項目的分析精密度和準確度的改變。49生化常規(guī)檢測項目及臨床意義

生化常規(guī)組合：（1）肝功能系列（2）糖尿病系列（3）腎功能系列（4）血脂系列（5）心肌酶譜系列501.丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷丙）：ALT、GPT【常規(guī)檢測項目】參考值范圍：0～40U/LALT大量存在于肝臟中，血清中含量極少，如果肝臟損傷，ALT會大量釋放入血清中。2天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（谷草轉(zhuǎn)氨酶谷草）：AST、GOT【常規(guī)檢測項目】參考值范圍：0～40U/LAST大量存在于肝臟及心肌中，血清中含量極少，如果肝臟損傷或心肌損傷，AST就會大量釋放入血清中（1）肝功能系列51（1）肝功能系列3堿性磷酸酶：ALP、AKP【常規(guī)檢測項目】參考值范圍：42～141U/L血清中的ALP主要來自于肝臟和骨骼，當(dāng)肝臟受損或骨骼疾病時，ALP會大量釋放入血清中。升高：肝臟損傷。降低：較少見，慢性腎炎、貧血。4.γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶：γ-GT、GGT【常規(guī)檢測項目】參考值范圍：0～50U/L血清中的γ-GT主要來自肝臟，如果肝臟損傷，γ-GT會大量釋放入血清中。升高：肝臟損傷。52（1）肝功能系列5.總膽紅素：TB、T.Bili、TBIL【常規(guī)檢測項目】（總膽紅素＝直接膽紅素＋間接膽紅素）參考值范圍：成人：2～20μmol/L/新生兒：20～200μmol/L正常情況下，膽紅素在體內(nèi)產(chǎn)生后，由肝細胞通過攝取、轉(zhuǎn)化和結(jié)合來清除膽紅素，使膽紅素在血清中維持一個較低的水平，如果肝細胞發(fā)生病變，不能有效清除膽紅素，則膽紅素會在血清中升高則膽紅素會在血清中升高。6.直接膽紅素（結(jié)合膽紅素）：DB、D.Bili、DBIL【常規(guī)檢測項目】參考值范圍：成人：0～6μmol/L升高：肝臟損傷。53（1）肝功能系列7.總蛋白：TP【常規(guī)檢測項目】（總蛋白＝白蛋白＋球蛋白）參考值范圍：60～83g/L總蛋白包括：白蛋白、前白蛋白、蛋白酶、糖蛋白、結(jié)合珠蛋白、巨球蛋白、銅藍蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、C-反應(yīng)蛋白。升高：常見于脫水、多發(fā)性骨髓瘤造成總蛋白合成增加、慢性肝臟疾病等。降低：常見于腎臟疾病、肝功能衰竭。8.白蛋白：ALB【常規(guī)檢測項目】參考值范圍：37～53g/L白蛋白由肝實質(zhì)細胞合成，在體內(nèi)起著極其重要的作用:運輸作用、維持滲透壓、緩沖酸堿、營養(yǎng)蛋白。下列情況會造成白蛋白降低：1）白蛋白合成不足：主要見于肝臟疾病，營養(yǎng)不良。2）白蛋白丟失：腎病、腸道疾病、燒傷及滲出性皮炎。3）白蛋白分解代謝增加：外科手術(shù)、創(chuàng)傷、炎癥。54（2）、糖尿病系列9.葡萄糖GLU【常規(guī)檢測項目】參考值范圍：3.9～6.1mmol/L血糖是指血液中的糖，在正常人血液中主要是葡萄糖。在多種激素的調(diào)節(jié)下血糖濃度維持在定范圍內(nèi)降低血糖的激素有：胰島素。升高血糖的激素有：胰高血糖素、腎上腺素、皮質(zhì)醇、生長激素。所以分泌上述激素的器官發(fā)生病變時，就會造成血糖濃度超出范圍。升高：發(fā)生于糖尿病、靜脈輸入含葡萄糖液體。降低：可見于胰島瘤、胰島素用藥、禁食。55（3）、腎功能系列10.尿素（urea）、尿素氮（BUN）【常規(guī)檢測項目】參考值范圍：2.5～6.3mmol/L尿素是人體蛋白質(zhì)代謝的終末產(chǎn)物，血清中的尿素可全部從腎小球濾過，當(dāng)腎小球病變影響濾過率時，就會造成血清中尿素升高。升高：見于腎功能障礙。降低：很少見，見于嚴重肝病。11.肌酐：CRE、Cr【常規(guī)檢測項目】參考值范圍：50～120μmol/L肌酐是肌酸的終末代謝產(chǎn)物，肌酸是在腎臟中合成。血漿中的肌酐由腎小球濾過，當(dāng)腎臟發(fā)生病變時，就會引起肌酐濃度的變化。升高：見于腎功能衰竭。降低：見于進行性肌萎縮。降低：見于進行性肌萎縮。56（3）、腎功能系列12.尿酸：UA【常規(guī)檢測項目】參考值范圍012043mmol/L參考值范圍：0.120.43mmol/L尿酸是嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，嘌呤代謝紊亂、能量代謝異常及腎臟對尿酸的排泄障礙都會引起尿量代謝異常及腎臟對尿酸的排泄障礙都會引起尿酸濃度的變化。升高：可見于腎功能障礙、痛風(fēng)。升高：可見于腎功能障礙、痛風(fēng)。降低：可見于使用腎上腺皮質(zhì)激素后。