基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性研究研究背景

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs），是婦科常見(jiàn)疾病之一，組織學(xué)上雖然是良性的，但卻有增生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)行為。藥物及手術(shù)治療復(fù)發(fā)率均高。究其原因主要是EMs的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。

自1921年Sampson首先提出子宮內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō)以來(lái)，在EMs眾多的病因及發(fā)病機(jī)制中，種植學(xué)說(shuō)雖被大多數(shù)學(xué)者所接受，但它無(wú)法解釋盆腔外EMs的發(fā)生，也無(wú)法解釋多數(shù)育齡婦女存在經(jīng)血逆流，但僅少數(shù)（10%-15%）發(fā)病。

越來(lái)越多的研究表明EMs與高血壓、糖尿病、精神分裂癥等一大類疾病一樣被認(rèn)為受多基因遺傳及多因素的影響?，F(xiàn)今的研究表明，子宮內(nèi)膜碎片必須通過(guò)粘附、侵襲及血管形成，方可以生存、生長(zhǎng)。這一過(guò)程的完成是由在位內(nèi)膜的不同生物學(xué)特征，即基因差異決定的。因此，當(dāng)前的研究重點(diǎn)在于尋找和鑒定EMs相關(guān)的遺傳基因。

PTEN(phosphataseandtensinhomologydeletedonchromosometen，PTEN)是1997年發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因，是繼P53基因之后發(fā)現(xiàn)的在人類腫瘤中突變率最高的基因。也是子宮內(nèi)膜腺癌中發(fā)現(xiàn)的突變率最高的基因，被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜的“看家基因”

。研究發(fā)現(xiàn)PTEN與子宮內(nèi)膜相關(guān)性疾病如EMs的發(fā)病密切相關(guān)。

PTEN通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞分化,抑制細(xì)胞粘附和遷移，誘導(dǎo)凋亡等參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜可能因抑癌基因PTEN失活而表現(xiàn)出與正常內(nèi)膜不同的生物學(xué)特性,如細(xì)胞粘附增強(qiáng)，凋亡減少，血管形成能力增強(qiáng)，從而容易在異位部位存活并生長(zhǎng)，繼而引起相應(yīng)的癥狀和體征。PTEN基因突變、雜合性缺失及多態(tài)性改變與多種腫瘤如食道癌、膀胱癌等的發(fā)病密切相關(guān)。其基因突變、雜合性缺失與EMS的相關(guān)性研究報(bào)道也較多，而PTEN多態(tài)性與EMS的相關(guān)性研究才處于探索階段。PTEN-9C/G(以下簡(jiǎn)讀為-9C/G）單核苷酸多態(tài)性(SNP)及PTENⅣS4-/+（以下簡(jiǎn)讀為IVS4-/+)為PTEN基因最常見(jiàn)的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，此兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性的改變與食道癌、鼻咽癌的相關(guān)性研究已見(jiàn)報(bào)道。國(guó)內(nèi)外目前尚無(wú)此兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性的改變與EMs的相關(guān)性研究報(bào)道。

PTEN-9C/GSNP位于PTEN翻譯起始點(diǎn)上游的第9位核苷酸處，C→G的替換使得G周期性地出現(xiàn)，它非常接近翻譯時(shí)使核糖體停留在閱讀框架內(nèi)的交感序列，因此C→G的替換可能影響PTEN的表達(dá)。

PTENⅣS4-/+為第4內(nèi)含子的一個(gè)插入性多態(tài)，可能通過(guò)不同剪切及通過(guò)與其它位點(diǎn)連鎖來(lái)影響其基因表達(dá)。本研究首次采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)技術(shù)對(duì)PTEN-9C/G及IVS4-/+基因進(jìn)行分型，旨在探討此兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與EMs

的關(guān)系。材料與方法

主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家潔凈工作臺(tái)上海力申科學(xué)儀器有限公司高速離心機(jī)TG19A.WS美國(guó)BECKMAN公司低溫離心機(jī)TGL-16H珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司普通冰箱

BCD-130H青島海爾股份有限公司電子天平PB3002-S瑞士Mettler公司PCR擴(kuò)增儀PTC一200美國(guó)MJReseareh公司Eppendorf移液器0.1-1000ul德國(guó)Eppendorf公司紫外掃描儀GelDoe1000美國(guó)BioRad公司穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-III3北京市六一儀器廠電泳槽Sub一Cell@Model96美國(guó)BioRad公司凝膠成像分析儀AlphaImagerTM2200美國(guó)AlphaInnotech公司

主要實(shí)驗(yàn)試劑試劑名稱生產(chǎn)廠商全血基因組DNA提取試劑盒北京博大泰克公司引物合成上海生工DNA膠回收試劑盒北京博大泰克公司PCR純化試劑盒上海生工蛋白酶K(Germany)Merck公司限制性內(nèi)切酶AflIINewEnglandBiolabs限制性內(nèi)切酶DraIINewEnglandBiolabs100bpDNAladder華美生物工程公司研究對(duì)象

EMs組：86人，無(wú)腫瘤性及遺傳性疾病病史，術(shù)后病檢證實(shí)為子宮內(nèi)膜異位癥的患者。對(duì)照組：64人，同期因輸卵管阻塞繼發(fā)不孕、宮外孕及子宮脫垂等手術(shù)，術(shù)后病檢排除EMs，且無(wú)腫瘤性及遺傳性疾病病史的患者。

標(biāo)本采集

采集每位研究個(gè)體的外周血3ml，EDTA抗凝，置4℃冰箱保存，并于采血后1周內(nèi)提取符合條件的研究對(duì)象的外周血白細(xì)胞DNA。實(shí)驗(yàn)方法微量全血基因組DNA提取試劑盒，提取全基因組DNA聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)，擴(kuò)增-9C/G和IVS4-/+多態(tài)位點(diǎn)的基因片段

分別PCR-AflII、PCR-DraII酶切消化后行基因分型

DNA的提取

用微量全血基因組DNA提取試劑盒，提取全基因組DNA。100μl裂解液20μlRNaseA/蛋白酶K

，55℃溫浴30min

12000rpm離心1min，棄盡上清

,100μlTE10000rpm離心1.5min,棄上清,300μl紅細(xì)胞裂解液300μl抗凝全血等體積紅細(xì)胞裂解液加入10μl3MnaAC、1250μl結(jié)合緩沖液加入600μl漂洗液加入30μlddH2O洗脫，-20℃保存24小時(shí)將所提DNA進(jìn)行Agarose電泳泳

PTEN的基因分型

采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法進(jìn)行基因分型。PTENIVS4-/+引物:上游引物：5'-GGGGGTGATAACAGTATCTA-3'下游引物：5'-CTTTATGCAATACTTTTTCCTA-3'dNTPs5μl

10XBuffer5μl

MgSO42μl

上下游引物各2μl

模板DNA100ng(1μl)

KOD-Plus1μl

ddH2O32μl

PCR反應(yīng)體系72℃延伸1min

58℃退火45s

94℃變性30s

94℃預(yù)變性5min

35個(gè)循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸5min

PCR反應(yīng)條件擴(kuò)增產(chǎn)物為403bp

PTENIVS4-/+PCR產(chǎn)物酶切電泳后判斷基因型

純化PCR產(chǎn)物10μl經(jīng)限制性內(nèi)切酶AflII(2μl)

于37℃酶切過(guò)夜

行2.5%瓊脂糖凝膠電泳

凝膠成像儀下觀察判斷基因型

-/-純合型顯示403bp一條電泳帶，+/+純合型顯示335bp和73bp兩條電泳帶，-/+雜合型顯示403bp、335bp和73bp三條電泳帶

PTEN-9C/G引物為:上游引物：5'-GCAGCCGTTCGGAGGATT-3'下游引物：5'-GCCGCAGAA,ATGGATACAGG-3'

PTEN-9C/GPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同擴(kuò)增PTENIVS4-/+。PTEN-9C/GPCR產(chǎn)物酶切電泳后判斷基因型

純化PCR產(chǎn)物10μl經(jīng)限制性內(nèi)切酶DraII(10μl)

于37℃酶切過(guò)夜

行2.5%瓊脂糖凝膠電泳

凝膠成像儀下觀察判斷基因型

C/C純合型顯示371bp的一條電泳帶G/G純合型顯示266bp和105bp兩條電泳帶C/G雜合型顯示371bp、266bp和105bp三條電泳帶

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

比較基因型頻率的觀察值與預(yù)期值，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)行Hardy-Weinberg平衡分析。病例組與對(duì)照組的基因型及等位基因分布采用卡方檢驗(yàn)，用OR值及其95%可信區(qū)間，分析PTEN-9C/G、IVS4-/+多態(tài)性與EMs的關(guān)系。結(jié)果

一.研究對(duì)象的一般特征：

1.平均年齡EMS組：35.4±7.69歲

對(duì)照組：35.6±12.24歲兩組比較，平均年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.122,P＞0.05)2.家族史

EMs陽(yáng)性家族史，

EMs組為24.4%，對(duì)照組僅10.9%，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.392,P＜0.05)。

EMs陽(yáng)性家族史明顯增加EMs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，OR值2.6308（95%CI=0.8117-5.1771）。二.PTEN基因ⅣS4-/+擴(kuò)增產(chǎn)物AflⅡ酶切電泳結(jié)果

PTENⅣS4-/-純合型產(chǎn)生403bp

一條電泳帶PTENⅣS4+/+純合型產(chǎn)生335bp和73bp兩條電泳帶PTENⅣS4-/+雜合型產(chǎn)生403b、335bp、73bp三條電泳帶

Fig.1GenotypepatternforPTENIVS4(-/+)polymorphismanalyzedbyPCR-AflIIdigestion.Lane1:+/+homozygousgenotype,Lane2:-/-homozygousgenotype,Lane3，4，5,and6:-/+heterozygousgenotype,

三.

PTEN基因-9C/G擴(kuò)增產(chǎn)物DraII酶切電泳結(jié)果:C/C純合型產(chǎn)生371bp的一條電泳帶G/G純合型產(chǎn)生266bp和105bp兩條電泳帶C/G雜合型產(chǎn)生371bp、266bp和105bp三條電泳帶

Fig.2GenotypepatternforPTEN-9C/GpolymorphismanalyzedbyPCR-DraIIdigestion.Lane1,4and6:C/Gheterozygousgenotype,Lane2and3:G/Ghomozygousgenotype,Lane5:C/Chomozygousgenotype.

GenotypeObservedExpectedΧ2andPEMs-/-1024.61-/+7242.79Χ2=32.25+/+418.60P<0.05Control-/-714.54

-/+4731.93Χ2=14.25+/+1017.53P<0.05四.PTENIVS4-/+多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布

Table2.PTEN-9C/GGenotypeHardy-WeinberyexaminationintwoGroupsGenotypeObservedExpectedΧ2andPEmsC/C7675.34C/G910.30Χ2=2.124G/G10.35P>0.05ControlC/C5858.14C/G65.72Χ2=0.154G/G00.14P>0.05五.PTEN-9C/G多態(tài)位點(diǎn)的基因型分布GroupEMSControlΧ2POR（95%CI）C/C76(88.4)58(90.6)

C/G9(10.4)6(9.4)

G/G1(1.2)0(0.0)

C/G+G/G10(11.6)6(9.4)0.1950.658

0.7862(0.7044-5.9662)

六.PTEN-9C/G基因型分布與EMs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)

GroupEMSControlΧ2

POR（95%CI）-/-10(11.6)

7(10.9)

-/+72(83.7)

47(73.5)

+/+4(4.7)

10(15.6)5.2390.073a

(-/-)+(-/+)82(95.3)54(84.4)5.220.02b

3.796(1.1328-12.7227)

七.PTENIVS4-/+基因型分布與EMs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)

EMS,n(%)Control,n(%)OR(95%CI)Χ2

P-valuea-9C/IVS4+71(41.28)62(48.44)1.00(reference)

-9C/IVS4-90(52.33)60(46.88)0.7634(1.2787-3.2865)1.2580.262-9G/IVS4+9(5.23)5(3.90)0.6362(0.6523-6.4426)0.6070.312-9G/IVS4-2(1.16)1(0.78)0.5726(0.1815-23.1593)

0.2080.555八.PTEN單體型與EMs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)討論

一.研究對(duì)象的一般特征

1.平均年齡EMS組：35.4±7.69歲

對(duì)照組：35.6±12.24兩組比較，平均年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.122,P＞0.05)說(shuō)明病例組與對(duì)照組年齡分布具有可比性。

2.家族史陽(yáng)性家族史,EMs組為24.4%，對(duì)照組為10.9%，兩者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.392,P＜0.05)。OR值2.6308（95%CI=0.8117-5.1771),說(shuō)明EMs陽(yáng)性家族史明顯增加EMs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

進(jìn)一步證實(shí)了EMs的家族遺傳傾向。

二.分析PTEN基因-9C/GSNP及IVS4-/+基因型及等位基因頻率分布情況本研究中PTEN-9C/GSNP的基因型分布在EMs病例組及對(duì)照組中均符合Hardy-Weinbery平衡，表明研究對(duì)象具有群體代表性。

PTENIVS4-/+基因型分布在EMs病例組及對(duì)照組中均不符合Hardy-Weinbery平衡，可能的原因有：突變、選擇、隨機(jī)遺傳漂變、遷移及遺傳異質(zhì)性。本研究人群中，PTENIVS4-/+雜合型(73.5%)明顯高于另兩種類型（-/-10.9%，+/+15.6%），這是Hardy-Weinbery平衡計(jì)算中影響其遺傳平衡的主要因素，可能跟遺傳選擇中的雜合子優(yōu)勢(shì)有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)照組中-9C/GSNP的基因型分布（C/C90.6%、C/G9.4%、G/G0.0%）與日本人群(C/C95.0%,C/G5.0%,G/G0%)相似；而IVS4-/+多態(tài)的基因型分布（-/-10.9%、-/+73.5%、+/+15.6%）與美國(guó)人群(-/-43.1%,-/+45.7%,+/+11.2%)有顯著差別。

在不同種族不同地區(qū)人群中PTEN基因的多態(tài)性可能分布相似或存在差異。三.分析PTEN-9C/G基因型分布與EMS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)

合并PTEN-9C/G及G/G基因型與C/C基因型相比，攜帶G等位基因(C/G+G/G)不改變EMs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，與張小愛(ài)及Ge等分別在PTEN-9C/G多態(tài)性與鼻咽癌及食道癌中的研究結(jié)果一樣。

位于PTEN非編碼區(qū)的-9C→G多態(tài)性改變可能不改變抑癌基因PTEN的功能，不增加EMs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。四.分析PTENIVS4-/+基因型分布與EMs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)

在合并PTENIVS4基因-/+和-/-后與+/+相比，病例組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

PTENⅣS4基因多態(tài)性中，突變型(+/+)可能降低EMs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。這與ⅣS4+/+基因型降低食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的報(bào)道一致，但與IVS4+/+基因型可增加較年輕者患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)的報(bào)道不同。

在不同類型腫瘤中,PTENⅣS4多態(tài)性發(fā)揮不同的作用,同時(shí)也存在不同人群中這一多態(tài)存在著對(duì)腫瘤易感性的差異的可能性。因此有必要在某一確定的人群中進(jìn)行不同類型疾病的研究,來(lái)評(píng)價(jià)PTENⅣS4多態(tài)性的作用。

五.分析PTEN單體型與EMs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)

在PTEN-9C/G和IVS4-/+構(gòu)成的單體中：-9C/IVS4-為EMs病例組中最常見(jiàn)