第5章植物的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.掌握植物組織培養(yǎng)基(MS)的配制(MurashigeandSkoog)

2.通過(guò)實(shí)驗(yàn)，掌握無(wú)菌操作方法，熟悉煙草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立的整個(gè)過(guò)程。3.學(xué)習(xí)再生體系的建立方法，為掌握其他植物的組織培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)；同時(shí)為轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供一個(gè)平臺(tái)。植物組織培養(yǎng)基的配制煙草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立實(shí)驗(yàn)用品：1.儀器和用品：500ml試劑瓶1個(gè)；100ml試劑瓶5個(gè)；250ml試劑瓶4個(gè)；高壓滅菌鍋；電子天平；燒杯（大、中、小各2個(gè)）、玻璃棒、移液管、搪瓷缸、培養(yǎng)瓶、電爐、pH計(jì)或精密pH試紙、容量瓶（大、中、小各1個(gè)）2.化學(xué)藥品及試劑漢語(yǔ)名分子式生產(chǎn)公司分子量純度硝酸銨NH4NO3上海通亞精細(xì)化工廠80.04分析純磷酸二氫鉀KH2PO4中國(guó)江蘇南京中山集團(tuán)公司化工廠136.09硝酸鉀KNO3上海鑫達(dá)精細(xì)化工有限公司101.10硫酸鎂MgSO4.7H2O山東省化工研究院246.47氯化鈣CaCl2.2H2O(上海)四聯(lián)化工廠147.03

硫酸錳MnSO4.4H2O上海試劑工廠169.02硫酸鋅ZnSO4.7H2O山東濰坊市試劑廠287.54硼酸H3BO3濟(jì)南化學(xué)試劑廠61.83碘化鉀KI上?；瘜W(xué)采購(gòu)站166.064鉬酸鈉Na2MoO4.2H2O北京五十六0一化工廠241.95分析純氯化鈣CaCl2.6H2O濟(jì)南試劑總廠237.93五水硫酸銅CuSO4.5H2O濟(jì)南化學(xué)試劑廠249.68

漢語(yǔ)名分子式生產(chǎn)公司分子量純度乙二胺四乙酸鈉Na2-EDTA.2H2O濟(jì)南試劑總廠372.24分析純硫酸亞鐵FeSO4.7H2O山東博山化學(xué)試劑廠278.01分析純

甘氨酸C2H5NO2中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所75.07分析純鹽酸吡哆醇C8H11O3N.HCl中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑站205.64鹽酸硫胺素C12H17ClH4OS.HCl中國(guó)新興化工試劑研究所337.27煙酸C6H5NO2北京芳草醫(yī)藥化工研制公司123.11化學(xué)純肌醇C6H12O6中國(guó)政翔化學(xué)試劑研究所180.16

3-吲哚乙酸IAA（b-Indoleaceticacid）天津天泰精細(xì)化工品有限公司125.1分析純萘乙酸NAAC12H10O2中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司186.21化學(xué)純?nèi)~酸C19H19O6N7上海化學(xué)試劑廠441.422,4-D（2,4-dichlorophenoxyaceticacid）上海雪滿(mǎn)生物科技有限公司6-BA（N6-benzylaminopurine）上海伯奧生物科技有限公司225.25蔗糖sucrose天津市廣成化學(xué)試劑有限公司342.29分析純瓊脂Agar國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司B.RMS培養(yǎng)基配制表母液化合物含量（終濃度）mg/L母液稱(chēng)量（mg）配制量（ml）吸取量（ml/L）1號(hào)NH4NO3KNO3KH2PO4MgSO4.7H2O16501900170370165001900017003700500（擴(kuò)大20倍）502號(hào)CaCl24404400同上503號(hào)ZnSO4.7H2OMnSO4.4H2OH3BO3NaMoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2OKI8.622.36.20.250.0250.0250.83430111531012.51.251.2541.5500（擴(kuò)大100倍）104號(hào)Na2－EDTAFeSO4.7H2O37.327.8746556100（擴(kuò)大200倍）55號(hào)VB1VB6甘氨酸煙酸（VB3）0.40.520.5202510025500（擴(kuò)大100倍）106號(hào)肌醇1001000100107蔗糖3％30g8瓊脂0.6％－1.2％8g

MS母液配制用量g.L-1每升培養(yǎng)基取用量mL/L大量元素(20倍)KNO338

NH4NO33350MgSO4·7H2O7.4KH2PO43.4CaCl·2H2O8.8微量元素(200倍)MnSO4·4H2O4.465ZnSO4·7H2O1.72H3BO31.24KI0.166NaMoO4·2H2O0.05CuSO4·5H2O0.005CoCl·6H2O0.005鐵鹽Na2-EDTA·2H2O7.465FeSO4·7H2O5.56有機(jī)附加物(200倍)甘氨酸(氨基乙酸)0.25VB60.05VB10.01煙酸0.05肌醇0.01生長(zhǎng)素類(lèi)在組培中的作用：誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化。常用種類(lèi)及作用：IAA(吲哚乙酸)、NAA、IBA、NOA（萘氧乙酸）、2.4－D、2.4.5－T（三氯苯氧乙酸）使用時(shí)先配成母液，母液的濃度一般為0.1mg/ml或1mg/ml；配時(shí)一般先將其粉末溶于95％乙醇或0.1mol/L的NaOH中，再定容。細(xì)胞分裂素類(lèi)在組培中的作用：促進(jìn)細(xì)胞分裂和由callus或器官上分化不定芽。常用種類(lèi)及作用：BAP（芐氨基嘌呤）、6－BA（芐基腺嘌呤），zip（異戊烯氨基嘌呤）和KN（激動(dòng)素）使用時(shí)先配成母液，母液的濃度一般為0.1mg/ml或1mg/ml；配時(shí)一般溶于0.5或1mol/L的HCl或稀薄的NaOH中，再定容。實(shí)驗(yàn)步驟：1.母液的配制：見(jiàn)MS培養(yǎng)基配制表2.培養(yǎng)基的配制：1）稱(chēng)取一定量的蔗糖，溶解于適量蒸餾水中（不能太多），倒入500ml容量瓶中。2）吸取各種母液（吸取量根據(jù)培養(yǎng)基的最終體積決定），加入到上述容量瓶中。3）吸取各種激素（所配制的培養(yǎng)基是：MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L），加入到上述容量瓶中。4)定容到500ml。5）將上述溶液調(diào)pH值到5.8-6.0。6)將上述溶液加入瓊脂后，于電爐上煮沸。7）將上述培養(yǎng)基冷卻至40-50攝氏度后，將其分裝到100ml三角瓶中。8）將三角瓶用封口膜封口。并對(duì)不同的培養(yǎng)基做好標(biāo)記。3.滅菌：通常培養(yǎng)基應(yīng)在汽相121攝氏度的條件下在高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌20min。在高壓滅菌鍋的加熱過(guò)程中，在氣壓指針上升到0.05Mpa時(shí)，放一次氣，然后在溫度達(dá)121攝氏度時(shí)，保持此壓力滅菌15-20min。滅菌完成后，待滅菌鍋的壓力降到0時(shí)，打開(kāi)滅菌鍋，取出培養(yǎng)基，放平，待培養(yǎng)基凝固后備用。注意事項(xiàng)：1.實(shí)驗(yàn)中所用的各種容器一定要洗凈、烘干。2.用電子天平稱(chēng)量藥品時(shí)，一定要用稱(chēng)量紙，對(duì)于有腐蝕性的藥品，應(yīng)將其放在小燒杯中稱(chēng)量。3.各種母液應(yīng)保存在2-4攝氏度的冰箱中，以免變質(zhì)、長(zhǎng)霉。4.用高壓滅菌鍋時(shí)，一定要先檢查一下其中的水是否合適。接種：在無(wú)菌的條件下，取煙草無(wú)菌苗的葉片，剪成（0.5～1cm）*(0.5～1cm)大小的小塊，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L中誘導(dǎo)愈傷組織，在此培養(yǎng)基上能誘導(dǎo)出愈傷組織并能夠誘導(dǎo)出不定芽。不定芽生根：將在愈傷組織中生成的不定芽移栽到1/2MS培養(yǎng)基中，其目的是誘導(dǎo)不定芽生根，使其發(fā)育成煙草小植株。植物材料滅菌的常用藥品和原理1.乙醇：原理：脫水作用和溶脂性，從而使Protein脫水、變性、沉淀及質(zhì)膜破損、透性增加，使微生物致死。使用濃度：70％（V/V）滅菌時(shí)間：5－60s2.次氯酸鹽：原理：在水中形成次亞氯酸（HClO），HClO分解后形成鹽酸和新生態(tài)氧（HClO→HCl+〔O-〕），〔O-〕具有很強(qiáng)的氧化性而具有殺菌作用。使用濃度：0.5％－2.5％的有效氯滅菌時(shí)間：5－15min3.升汞（HgCl2）：原理：汞離子可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使菌體蛋白變性，酶失活。其殺菌效力極強(qiáng)。使用濃度：0.1-0.2％（W/V）滅菌時(shí)間：10min4.新潔爾滅：原理：廣譜表面活性滅菌劑。使用濃度：1：200（V/V）滅菌時(shí)間：30min或更長(zhǎng)

接種第一天

接種第二