實時熒光定量第一頁，共三十二頁，2022年，8月28日內容Real-timePCR原理Real-timePCR用途Real-timePCR實驗第二頁，共三十二頁，2022年，8月28日PCR原理常規(guī)PCR：擴增DNA，借助電泳對擴增反應的終產物進行半定量及定性分析變性退火延伸Y0×2×4×8×16……Y0×2n第三頁，共三十二頁，2022年，8月28日實時熒光定量PCR:擴增DNA，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化，最終精確的對起始模板的定量分析Real-timePCR原理Y0×2×4×8×16……Y0×2n擴增曲線背景期對數增長期線性增長期平臺期第四頁，共三十二頁，2022年，8月28日熒光嵌合法（非特異性）SYBRGreenI熒光探針法（特異性）TaqManprobeCyclingprobe……RealTimePCR的熒光化學檢測原理第五頁，共三十二頁，2022年，8月28日非特異性的熒光嵌合法——

SYBRGreenI

SYBRGreenI是一種能夠結合于所有雙鏈DNA小溝中的熒光染料，SYBR與PCR合成DNA雙鏈結合后，發(fā)射熒光信號，而游離的SYBR不會發(fā)射熒光信號，因此熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步優(yōu)點：簡單易行，成本較低缺點：與非特異性產物結合，不能進行多重PCR適用：不同樣本同一基因相對表達量分析第六頁，共三十二頁，2022年，8月28日特異性熒光探針法——TaqManprobeTaqman探針是一段與目的基因配對的DNA序列，5‘端加熒光物質，3‘端加淬滅物質，完整探針5‘端的熒光物質被3‘端淬滅物質抑制，不發(fā)熒光，當PCR合成DNA，退火時探針和DNA配對，延伸時，由于DNA聚合酶也有核酸外切酶活性，將探針分解，5‘端熒光物質游離出來，發(fā)出熒光，檢測熒光強度，表征PCR擴增的DNA量。優(yōu)點：特異性強，能進行多重PCR缺點：需設計特異性探針，成本較高適用：區(qū)別同源性高的序列，SNP解析等多重PCR檢測第七頁，共三十二頁，2022年，8月28日重要術語:閾值（Threshold）：在擴增曲線指數增長期設定的熒光檢出界限（第3～15個循環(huán)的熒光信號標準偏差的10倍）C(t)值（Cycleofthreshold）：熒光信號（擴增產物）到達閾值時所經過的擴增循環(huán)次數閾值C(t)值

18.12+/-0.0418.12+/-0.0418.12+/-0.04C(t)值18.12+/-0.04RealTimePCR的數學定量原理第八頁，共三十二頁，2022年，8月28日絕對定量相對定量RealTimePCR的數學定量原理初始DNA量越多，越早達到閾值，擴增曲線越早起峰，Ct值越小經數學理論證明，初始DNA量的對數值與循環(huán)數/Ct呈反比線性關系腫瘤正常第九頁，共三十二頁，2022年，8月28日絕對定量將已知濃度的標準品進行梯度稀釋，進行RealTimePCR,會得到一系列等間隔的擴增曲線。以它們的Ct值作橫坐標，初始DNA量的對數值為縱坐標，作圖得到標準曲線，未知濃度的樣品進行RealTimePCR,得到Ct值，代入標準曲線，可以樣品的初始DNA量。10410310610510210熒光強度---循環(huán)數曲線初始DNA量對數---Ct循環(huán)數標準曲線絕對定量通過標準曲線確定初始DNA/RNA基因拷貝數或濃度，通常用于病毒，病原菌的定量檢測即轉基因食品食品的檢測。第十頁，共三十二頁，2022年，8月28日相對定量比較不同樣本之間基因表達量的高低變化，需要做相對定量。相對定量引入內參基因，即維持細胞基本代謝活動所必需的基因，其表達量在不同的細胞里基本一樣，在擴增目的基因的同時擴增內參基因，用不同樣本的目的基因的擴增量與各自內參基因的擴增量的比值對目的基因表達量進行均一化后，再比較高低，可以對不同樣本間細胞起始數，RNA提取效率，基因擴增效率的不同進行矯正。第十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日Real-timePCR用途定性分析:病毒和病原菌檢測;單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測;物種鑒定定量分析:絕對定量:病毒和病原菌定量;基因拷貝數分析;轉基因定量分析相對定量:基因表達量分析基因表達的中心法則第十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日Real-timePCR實驗

——以癌細胞藥物處理后不同時間點某基因表達量的變化為例SYBRgreen1的相對定量法：一、實驗設計，材料處理，取材凍存二、目的和內參基因的選擇及引物設計三、準備試劑與耗材，預約儀器四、RNA提取，質量與濃度檢測，反轉錄成cDNA五、按反應體系準備樣品六、上機設定反應條件，運行程序進行反應七、溶解曲線分析熒光信號產生的特異性八、獲得數據，計算分析結果并做圖第十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日對照組Control處理組Drug112h重復1重復2重復30h3h6h12h重復1重復2重復33h6h一實驗設計，材料處理，取材凍存（-80℃）菌檢健康的癌細胞對照組處理組0h#1#2#33h#4#5#6#7#8#96h#10#11#12#13#14#1512h#16#17#18#19#20#21第十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日二目的和內參基因的選擇及引物設計目的基因的選擇：根據實驗目的內參基因的選擇：維持細胞基本代謝活動所必需的基因，如GAPDH，Actin，18SrRNA等通過查文獻或實驗篩選第十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日引物設計注意事項：引物設計軟件Oligo7第十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日三、準備試劑，耗材，預約儀器試劑：RNA提取試劑盒，cDNA反轉錄試劑盒（≥21次反應），SYBRmix（≥21×2次反應）等耗材：槍頭，EP管等（無RNase處理），96/384孔版，透明薄膜，冰及冰盒等儀器：槍，離心機，Nanodrop核酸濃度測定儀，核酸電泳儀，熒光定量PCR儀等第十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日四、RNA提取，質量與濃度檢測，反轉錄成cDNA針對樣品選用一款合適的RNA提取試劑盒取相同量的組織或細胞提取總RNA提取的總RNA?；煊谢蚪MDNA，可以通過DNase處理去除或跨內含子引物設計避免基因組DNA擴增RNA電泳檢測降解情況Nanodrop測定RNA濃度和純度（OD260/280≥2，OD260/230≥2）取相同量的RNA（如1ug）做反轉錄RNA易降解，而cDNA可于-20℃保存很久第十八頁，共三十二頁，2022年，8月28日五、按反應體系準備樣品上述cDNA需要進行稀釋，稀釋倍數實驗摸索（使內參Ct約20）每個樣品做2個技術重復，事先設計好樣品在96孔板上的排列先把稀釋好的cDNA加到96孔板，再加混好的SYBRmixture,primer,H2O加入96孔板，蓋上透明薄膜，離心后上機反應體系：內參×42目的×42TemplatecDNA4uL2×SYBRmixture10uL420uL420uLForwardprimer0.5uL21uL21uLReverseprimer0.5uL21uL21uLH205uL220uL220uLTotal20uL內參目的112233445566778899101011111212131314141515161617171818191920202121112233445566778899101011111212131314141515161617171818191920202121第十九頁，共三十二頁，2022年，8月28日六、上機設定反應條件，運行程序進行反應參考SYBRgreen1Kit的說明書預變性：95℃,30s,20℃/s——1cyclePCR反應：95℃,5s,20℃/s60℃,20s,20℃/s——40Cycles溶解曲線分析：95℃,

0s,20℃/s72℃,

15s,20℃/s95℃,

0s,0.3℃/s第二十頁，共三十二頁，2022年，8月28日七、從溶解曲線確認PCR反應的特異性溶解曲線的一次曲線溶解曲線的負一次曲線微分曲線PCR反應結束后，擴增產物呈雙鏈，具有較高的熒光信號強度，此時，將PCR反應液的溫度漸漸升高，DNA雙鏈漸漸打開，嵌入DNA雙鏈中的SYBRGreen數量減少，熒光信號強度漸漸降低，當雙鏈DNA解鏈一半時，熒光信號強度急劇下降，此時的溫度即溶解溫度（Tm值），對于某一特定的PCR擴增產物，其值是固定的。第二十一頁，共三十二頁，2022年，8月28日八、獲得數據，計算分析結果并做圖樣品內參Ct目的Ct相對表達量120.15120.12220.13220.14319.88319.99420.45420.21519.45519.70………………Power(內參Ct-目的Ct，2)第二十二頁，共三十二頁，2022年，8月28日謝謝關注，歡迎交流討論！第二十三頁，共三十二頁，2022年，8月28日聚合酶鏈式反應PCR原理常規(guī)PCR：擴增DNA，借助電泳對擴增反應的終產物進行半定量及定性分析第二十四頁，共三十二頁，2022年，8月28日常規(guī)PK實時PCR

實時熒光定量PCR

常規(guī)PCR能進行定量或定性分析靈敏度高，精確度高不需要電泳分析，省時，安全，不易污染需要熒光定量PCR儀，熒光染料等，成本較高只能進行半定量或定性分析靈敏度低，精確度低需要電泳分析，費時，不安全，易污染只需要普通PCR儀與PCR試劑，成本較低第二十五頁，共三十二頁，2022年，8月28日各種熒光檢測方法比較SYBRgreentaqmanCycling優(yōu)點缺點適用范圍第二十六頁，共三十二頁，2022年，8月28日RealTimePCR定量的數學原理理想的PCR反應：Yn=Y0×2n非理想的PCR反應：Yn=Y0(1+Ex)n方程式兩邊同時取對數得: logYn=log［Y0(1+Ex)n］整理方程式得: logY0=［-log(1+Ex)］×n+logYn將Ct和YCt帶入上式得：

logY0=［-log(1+Ex)］×Ct+logYCtn：擴增反應的循環(huán)次數Yn：第n次循環(huán)后的產物量Y0：初始DNA量Ex：擴增效率初始DNA量的對數值與循環(huán)數/Ct呈反比線性關系第二十七頁，共三十二頁，2022年，8月28日Real-timePCR用途定性分析定量分析絕對定量相對定量病毒和病原菌檢