DNA重組技術的基本工具“分子運輸車“”分子手術刀““分子縫合針”例如：培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程提取棉花細胞(含抗蟲基因)蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因與運載體DNA拼接導入普通棉花(無抗蟲特性)棉花植株(有抗蟲特性)基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序：獲：目的基因的篩選與獲取構(gòu)：基因表達載體的構(gòu)建導：將目的基因?qū)胧荏w細胞檢：目的基因的檢測和鑒定（核心）一、目的基因的篩選與獲取1．目的基因(1)概念：用于改變_______________或獲得_______________等的基因。受體細胞性狀預期表達產(chǎn)物(2)實例：與生物抗逆性相關的基因（Bt抗蟲基因）與優(yōu)良品質(zhì)相關的基因與生物藥物和保健品相關的基因（胰島素、干擾素基因）與毒物降解相關的基因與工業(yè)用酶相關的基因等主要指編碼蛋白質(zhì)的基因。2．篩選合適的目的基因(1)較為有效的方法：從相關的______________和____________的基因中進行篩選。(2)實例：已知結(jié)構(gòu)功能清晰Bt抗蟲蛋白基因（Bt基因）的篩選過程

當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結(jié)合，導致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。相關信息：Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理：思考討論：抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會不會對人畜產(chǎn)生危害？

Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響。3．利用PCR獲取和擴增目的基因(1)PCR的概念：PCR是________________的縮寫，它是一項根據(jù)__________________的原理，在體外提供______________的各種組分與反應條件，對_____________________進行大量復制的技術。聚合酶鏈式反應DNA半保留復制參與DNA復制目的基因的核苷酸序列提取蘇云金桿菌抗蟲基因？快速獲得大量抗蟲基因3．利用PCR獲取和擴增目的基因(1)PCR的概念：PCR是________________的縮寫，它是一項根據(jù)__________________的原理，在體外提供______________的各種組分與反應條件，對_____________________進行大量復制的技術。聚合酶鏈式反應DNA半保留復制參與DNA復制目的基因的核苷酸序列①全稱：②原理：③操作環(huán)境：④目的：⑤優(yōu)點：聚合酶鏈式反應DNA半保留復制體外（PCR擴增儀/PCR儀）對目的基因的核苷酸序列進行大量復制短時間內(nèi)大量擴增目的基因耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）PCR條件:四種脫氧核苷酸(dNTP)激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶3．利用PCR獲取和擴增目的基因注：引物是一小段能與________的一段堿基序列________的___________。

用于PCR的引物有

種，長度通常為20~30個核苷酸。DNA母鏈互補配對短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物2

3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性

當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈B.復性當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合C.延伸當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈PCR反應過程：3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴增目的基因第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應的模板，經(jīng)過變性、復性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應的模板，經(jīng)過變性、復性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪的產(chǎn)物完成以后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物③PCR反應過程一.目的基因的篩選與獲取PCR反應的過程動畫：受熱變性引物

耐高溫的DNA聚合酶PCR技術

(1)過程：(2)條件：DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種_______、四種______________、____________________。引物脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶（3）結(jié)果：1個模板DNA分子經(jīng)過n輪PCR，以_____方式擴增，可以擴增出

個DNA片段。指數(shù)2n【知識小結(jié)】PCR技術與生物體內(nèi)DNA復制的比較比較項目生物體內(nèi)DNA復制PCR技術

區(qū)別解旋方式場所酶溫度條件合成對象解旋酶催化細胞內(nèi)(主要在細胞核內(nèi))DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等細胞內(nèi)溫和條件DNA分子DNA在高溫作用下變性解旋細胞外(在PCR擴增儀內(nèi))耐高溫的的DNA聚合酶(Taq聚合酶)需控制溫度，在較高溫度下進行DNA片段或基因聯(lián)系①模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進行物質(zhì)合成②原料：均為四種脫氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶進行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸PCR技術與生物體內(nèi)DNA復制的比較用PCR可以直接擴增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進行擴增。①逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；②核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；③以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA獲得了足量的目的基因后，是否能直接將目的基因?qū)胧荏w細胞呢？若這樣操作，效果如何？——核心步驟1．基因表達載體構(gòu)建的目的：二、基因表達載體的構(gòu)建確保目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在和表達，并且能遺傳給下一代。2．基因表達載體的組成：限制酶切割位點啟動子終止子質(zhì)粒復制原點標記基因便于重組DNA分子的篩選目的基因、標記基因、啟動子、終止子等位置:位于基因的下游功能:終止轉(zhuǎn)錄本質(zhì):有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位置:位于基因的上游功能:是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA本質(zhì):有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段——核心步驟二、基因表達載體的構(gòu)建目的基因必須插入到

與

之間。啟動子終止子重組DNA分子限制酶3.基因表達載體的構(gòu)建過程目的基因限制酶切割位點獲取目的基因DNA連接酶限制酶啟動子限制酶切割位點終止子標記基因復制原點質(zhì)粒同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶？【典例】如圖是利用基因工程技術培育轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性內(nèi)切核酸酶。下列說法錯誤的是(

)BA.卡那霉素抗性基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來B.表達載體構(gòu)建時需要用到限制酶SmaⅠC.圖示過程是基因工程的核心步驟D.除圖示組成外，表達載體中還應該含有啟動子和終止子等結(jié)構(gòu)辨析：“啟動子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”啟動子與終止子位于DNA分子中；作用：起始和終止轉(zhuǎn)錄過程。起始密碼子與終止密碼子位于mRNA分子中；作用：起始和終止翻譯過程。三、將目的基因?qū)胧荏w細胞（一）導入植物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法(最多)

導入方法1.花粉管通道法：我國科學家獨創(chuàng)①用___________將___________________直接注入____中；微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去____，將________滴加在________上，使目的基因借助___________進入_____；柱頭DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊受體細胞：受精卵子房花粉柱頭花粉管精子卵細胞胚囊③花粉管通道法的過程：

目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①轉(zhuǎn)化：②農(nóng)桿菌特點：a.能在自然條件下侵染___________和_________，而對大多數(shù)___________沒有侵染能力；雙子葉植物裸子植物單子葉植物b.農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有______，當它侵染植物細胞后，能將______上的______（___________）轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且將其_________________________；Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒T-DNA可轉(zhuǎn)移的DNA整合到該細胞的染色體DNA上

將目的基因插入_____________中，通過農(nóng)桿菌的_____作用，就可以使目的基因___________③利用農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化的思路：Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化進入植物細胞（一）導入植物細胞④農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程：T-DNA目的基因構(gòu)建表達載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導入植物細胞表現(xiàn)出新性狀的植物植物細胞將目的基因插入染色體DNA中植物組織培養(yǎng)兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上。兩次導入：第一次導入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌；第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導入受體細胞。

提醒：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接、兩次導入⑤轉(zhuǎn)化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細胞，并再生成植株；受體細胞為_______體細胞b.可以將____直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得____，再進行篩選、鑒定等；受體細胞為_______花序種子受精卵2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（一）導入植物細胞——顯微注射法1.受體細胞：受精卵。(因為受精卵容易表現(xiàn)出全能性)2.過程：構(gòu)建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物（二）導入動物細胞（轉(zhuǎn)基因動物)——Ca2+處理法1.受體細胞：

常用原核生物作為受體細胞，其中以大腸桿菌最廣泛。2.原核生物的優(yōu)點:

繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)相對較少、易于培養(yǎng)。3.過程:2023/2/7Ca2+處理大腸桿菌使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)將重組的基因表達載體導入其中（Ca2+的作用：增加細胞壁的通透性）（感受態(tài)細胞）（三）導入入微生物細胞Ca2+感受態(tài)細胞吸收生物種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法;花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法(感受態(tài)細胞法)受體細胞體細胞或受精卵受精卵原核細胞小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細胞(1)花粉管通道法是我國科學家獨創(chuàng)的一種方法，主要適用于雙子葉植物和裸子植物。()解析：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法主要適用于雙子葉植物和裸子植物。(2)農(nóng)桿菌侵入植物細胞后，其Ti質(zhì)粒上的T－DNA能轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并且整合到該細胞的染色體DNA上。()(3)培育轉(zhuǎn)基因動物時，常選擇受精卵作為受體細胞，利用顯微注射法將目的基因直接注入受精卵中。(

)(4)將目的基因?qū)朐思毎麜r，通常用大腸桿菌作為受體細胞，并需要用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)。(

)×√√√【基礎過關】【典例】下列關于目的基因?qū)胧荏w細胞的方法中，不正確的是(

) A.我國利用花粉管通道法培育了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉 B.用Ca2＋處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細胞 C.將目的基因?qū)雱游锛毎畛Ｓ?、最有效的方法是顯微注射法 D.利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育大多單子葉轉(zhuǎn)基因植物

解析：目前我國的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是利用花粉管通道法培育的，A正確；為使大腸桿菌易吸收DNA分子，應先用氯化鈣溶液進行處理，使大腸桿菌處于易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)，B正確；顯微注射技術是將目的基因?qū)雱游锛毎顬橛行У囊环N方法，C正確；農(nóng)桿菌對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力，D錯誤。D【檢測】菊花是一種雙子葉植物，易感桃蚜。桃蚜不但直接影響植物生長，還是多種植物病毒的傳播媒介。雪花蓮凝集素基因GNA的表達產(chǎn)物能有效抑制桃蚜生長。某科研團隊運用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)GNA基因菊花。下列有關敘述錯誤的是(

)A．受體細胞可以選擇菊花葉片細胞或桃蚜細胞B．將目的基因GNA插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上構(gòu)建表達載體C．菊花外植體產(chǎn)生的酚類化合物能吸引農(nóng)桿菌移向受體細胞D．應用抗蟲接種實驗，檢測轉(zhuǎn)基因菊花對桃蚜的抗性及抗性的程度A1、目的基因的篩選與獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作的四個步驟思考：將目的基因成功導入受體細胞后，為什么還要進行目的基因的檢測與鑒定？

檢查目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性；目的:（一）檢測內(nèi)容及方法:類型檢測內(nèi)容方法分子水平的檢測個體生物學水平的鑒定受體細胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術個體是否具有相應性狀病原體接種實驗等四、目的基因的檢測與鑒定檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)—

抗原-抗體雜交蛋白質(zhì)（抗原）提取蘇云金桿菌Bt抗蟲蛋白提取抗體出現(xiàn)沉淀轉(zhuǎn)基因抗蟲棉說明轉(zhuǎn)基因抗蟲棉表達出了Bt抗蟲蛋白抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等個體水平鑒定（二）鑒定——轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進行功能活性比較功能、活性正常(1)常使用PCR等技術，從分子水平上檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或Bt基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。()(2)從分子水平上檢測目的基因是否翻譯出相關蛋白質(zhì)的方法之一是利用抗原—抗體雜交技術。()(3)可以通過鹽堿地栽培試驗