微生物遺傳與育種第七章第一節(jié)

微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)

一、遺傳物質(zhì)化學(xué)本質(zhì)的確證1、DNA（或RNA）是遺傳信息的攜帶者三個經(jīng)典實驗

細菌轉(zhuǎn)化實驗噬菌體感染實驗病毒重建實驗動物實驗細菌培養(yǎng)實驗

熱死S菌―――→不生長

活R菌―――→長出R菌

熱死S菌+活R菌――→長出大量R菌和10-6S菌S型菌的無細胞抽提液試驗

活R菌+S菌無細胞抽提液――→長出大量R菌和少量S菌培養(yǎng)皿培養(yǎng)培養(yǎng)皿培養(yǎng)培養(yǎng)皿培養(yǎng)培養(yǎng)皿培養(yǎng)1944年Avery等對熱死S型菌中可能的轉(zhuǎn)化因子在離體條件下進行了轉(zhuǎn)化試驗：活R菌長出S菌只有R菌加S菌DNA

加S菌的RNA加S菌的莢膜多糖加S菌的蛋白質(zhì)加S菌的DNA和DNA酶加S菌DNA及DNA酶以外的酶病毒重建實驗H.Fraenkel-Conrat，1956實驗材料煙草花葉病毒（TMV）霍氏車前花葉病毒（HRV）處理在一定濃度的苯酚溶液中振蕩，分離蛋白質(zhì)外殼與RNA核心3、DNA的復(fù)制半保留復(fù)制復(fù)制起點、復(fù)制方向、復(fù)制單位DNA的半不連續(xù)復(fù)制3535解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)3-OH5-P55533335'滾環(huán)復(fù)制5'53354、生物染色體、病毒遺傳物質(zhì)原核生物的染色體核區(qū)，無核膜包裹，DNA裸露，不與蛋白形成復(fù)合體染色體組成：DNA、RNA、蛋白質(zhì)往往只有一條染色體，大多數(shù)以雙鏈、共價閉合的環(huán)狀形式存在真核生物的染色體核膜包裹，線性DNA與組蛋白結(jié)合形成染色體染色體不止一個，每個染色體中含有1個線性DNA分子細胞分裂中期呈棍棒狀，靜止期為顆粒狀染色體基本組成單位：核小體兩種生物染色體DNA復(fù)制區(qū)別復(fù)制子大小、數(shù)量上差異復(fù)制起點、復(fù)制速度、方向上差異一、基因概念和微生物的基因結(jié)構(gòu)概念一段具有特定功能和結(jié)構(gòu)的連續(xù)的DNA片斷，是編碼蛋白質(zhì)或RNA分子遺傳信息的基本遺傳單位。原核生物基因的結(jié)構(gòu)真核生物基因的結(jié)構(gòu)一般無操縱子結(jié)構(gòu)存在大量不編碼序列和重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯在細胞中有空間間隔基因被許多無編碼功能的內(nèi)含子阻隔，使編碼序列變成了不連續(xù)的外顯子。二、基因組基因組（genome）單倍體細胞中所含的全套遺傳物質(zhì)大多數(shù)細菌和噬菌體基因組是指單個染色體上所含的全部基因二倍體真核生物基因組是指單倍體細胞核內(nèi)整套染色體所含的DNA分子及其所攜帶的全部基因第三節(jié)

質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子

PlasmidandTransposon一、質(zhì)粒概述質(zhì)粒（plasmid）存在于各種微生物細胞中、獨立于染色體外、能進行自主復(fù)制的遺傳因子。特點可自我復(fù)制、穩(wěn)定遺傳；非必需；可轉(zhuǎn)移；可整合；可重組；可消除質(zhì)粒的大小和復(fù)制三、質(zhì)粒的主要類型據(jù)質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng)分類致育因子（Fertilityfactor，F(xiàn)因子）抗性因子（Resistancefactor，R因子）產(chǎn)細菌素的質(zhì)粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性質(zhì)粒（virulenceplasmid）代謝質(zhì)粒（Metabolicplasmid）隱秘質(zhì)粒（crypticplasmid）R100質(zhì)粒(89kb)可使宿主對下列藥物及重金屬具有抗性：汞離子（mer）磺胺(sul)鏈霉素(str)梭鏈孢酸（fus）氯霉素(cam)四環(huán)素(tet)R100質(zhì)粒的遺傳圖譜四、轉(zhuǎn)座子的類型和分子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)座因子（transposableelement）的概念可在DNA鏈上改變自身位置的一段DNA序列。轉(zhuǎn)座因子的共同特征插入寄主DNA后，導(dǎo)致基因失活；轉(zhuǎn)座以后，原來的轉(zhuǎn)座子依然保持在原位，而在靶序列上復(fù)制了一個轉(zhuǎn)座子；插入時在靶DNA位點產(chǎn)生一個短的正向重復(fù)序列。根據(jù)轉(zhuǎn)座機理不同分類轉(zhuǎn)座子反轉(zhuǎn)座子原核生物中的轉(zhuǎn)座因子類型插入（IS）序列轉(zhuǎn)座子(Tn)某些溫和噬菌體插入序列（insertionsequence,IS）特點在IS兩端含有長為10-40bp反向重復(fù)序列（IR）。大多IS都含有一個引起轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座酶基因。在IS插入時，在靶DNA位點產(chǎn)生一個長度3-9bp正向重復(fù)序列，分布在IS兩側(cè)。分布在細菌染色體、質(zhì)粒、某些噬菌體DNA上轉(zhuǎn)座子(Tn)除了與轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因外，還含有抗性基因（對抗生素、某些毒物）、乳糖發(fā)酵基因等幾個至十幾個基因。IS與Tn有兩個共同特征都攜帶有編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，該酶為轉(zhuǎn)座所必需；兩端都有反向末端重復(fù)序列，只是長度不同。IS與Tn主要區(qū)別Tn攜帶有與轉(zhuǎn)座無關(guān)的抗性基因或其它特性基因細菌抗藥性轉(zhuǎn)座子的兩種類型復(fù)合轉(zhuǎn)座子由兩個完全相同或類似的插入序列IS和某種抗藥性基因組成的復(fù)合因子。復(fù)雜轉(zhuǎn)座子兩端具有IR或DR，而不是IS，中部的編碼區(qū)不僅編碼抗性標(biāo)記，還編碼轉(zhuǎn)座酶和解離酶。兩個IR中任一個缺乏都會阻遏轉(zhuǎn)座特殊病毒（Mu噬菌體）與其他溫和性噬菌體的差別：其基因組不論在進入裂解周期或處于溶源狀態(tài)都可隨機整合到宿主染色體的任何位置，且游離的和已整合的基因次序是相同的。沒有固定的整合位置轉(zhuǎn)座子的遺傳效應(yīng)遺傳效應(yīng)插入突變DNA重排極性效應(yīng)第四節(jié)

基因突變與遺傳育種

一、基因突變突變的概念變異的一種，指生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳性變化。突變率常在10-8~10-9范圍內(nèi)。按突變涉及的范圍分基因突變?nèi)旧w畸變基因突變的類型從突變的效應(yīng)來分

原序列5‘-AUGCCUUCAAGAUGUGGGMetProSerArgCysGly(1)同義突變5‘-AUGCCUUCAAGAUGUGGAMetProSerArgCysGly(2)錯義突變5‘-AUGCCUUCAGGAUGUGGAMetProSerGlyCysGly(3)無義突變5‘-AUGCCUUCAAGAUGAGGAMetProSerArg按突變所帶來的表型改變分形態(tài)突變型

因突變而產(chǎn)生的個體形態(tài)或菌落形態(tài)的變異生化突變型營養(yǎng)缺陷型抗性突變型致死突變型條件致死突變型突變后在某種條件下可正常生長、繁殖并實現(xiàn)其表型，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型突變的機制突變自發(fā)突變?nèi)旧w畸變：缺失、添加、易位、倒位誘變移碼突變（缺失添加）點突變堿基置換（轉(zhuǎn)換顛換）二、突變與育種自發(fā)突變與自然選育1、自發(fā)突變的特點自發(fā)性

突變的結(jié)果與原因之間的不對應(yīng)性稀有性

10-9～10-6誘變性獨立性：一個基因的突變對其它基因突變物影響，同時發(fā)生2個突變的幾率很低。穩(wěn)定性可逆性2、自然選育目的純化與復(fù)壯菌種，保持穩(wěn)定的生產(chǎn)性能步驟通過表現(xiàn)形態(tài)來淘汰不良菌株——初篩通過目的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量考察——復(fù)篩進行遺傳基因型純度試驗傳代穩(wěn)定性試驗誘發(fā)突變與誘變育種概念誘發(fā)突變指人為地運用物理、化學(xué)或生物的方法處理微生物，使其遺傳物質(zhì)發(fā)生變異，從而達到改變其表型的目的。誘變育種指人為地、有意識地將對象生物置于誘變因子中，使該生物發(fā)生突變，從這些突變體中篩選具有優(yōu)良性狀突變株的過程。常用的誘變劑物理誘變劑、化學(xué)誘變劑、生物誘變劑誘變處理的基本方法誘變劑的選擇了解誘變劑的性質(zhì)、作用機理、使用方法充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)一次復(fù)合因子處理后需經(jīng)多次分離純化。劑量的選擇一般誘變效應(yīng)隨劑量增高而增高，達到一定劑量后，再增大劑量誘變率反而下降。誘變劑量確定與出發(fā)菌株特性、誘變劑性質(zhì)、實際效果有關(guān)。增效劑影響誘變效果的因素出發(fā)菌株出發(fā)菌株的生理狀態(tài)細菌——對數(shù)生長期真菌、放線菌——幼年孢子外部環(huán)境誘變方法物理誘變化學(xué)誘變合適的誘變因素劑量微生物的誘變育種的步驟和方法優(yōu)良突變菌種的篩選初篩以量為主，復(fù)篩以質(zhì)為主直接搖瓶篩選法數(shù)據(jù)直觀可靠，與生產(chǎn)接近，但工作量大一般都應(yīng)進行單菌分離注意及時保藏營養(yǎng)缺陷型菌株篩選與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基（MM，minimalmedium）“[－]”僅能滿足某微生物的野生型菌株生長需要的最低成分組合培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM，completemedium）“[＋]”滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的組合培養(yǎng)基。補充培養(yǎng)基（SM，supplementalmedium）只能滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型生長需要的組合培養(yǎng)基。補充培養(yǎng)基的符號可根據(jù)加入的是A或B等代謝物而分別用[A]或[B]等來表示。營養(yǎng)缺陷型菌株篩選方法獲得野生型菌株→誘變劑處理→淘汰野生型→檢出營養(yǎng)缺陷型→鑒定缺陷型中間培養(yǎng)：完全培養(yǎng)基或補充培養(yǎng)基淘汰野生型菌株抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法、饑餓法營養(yǎng)缺陷型檢出夾層培養(yǎng)法、限量補充培養(yǎng)法、逐個檢出法、影印接種法夾層培養(yǎng)法影印接種法確定生長譜三、基因重組和微生物育種基因重組（generecombination）兩個獨立基因組內(nèi)的遺傳基因通過一定的途徑轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新遺傳基因組的過程。核酸分子水平上的雜交重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，產(chǎn)生新遺傳型的個體?；蛑亟M的方式原核微生物的基因重組轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、原生質(zhì)體融合真核微生物的基因重組有性雜交、準(zhǔn)性雜交、原生質(zhì)體融合原核微生物的基因重組轉(zhuǎn)化（transformation）受體菌直接接受來自供體菌的DNA片段，通過交換組合將其整合到自己基因組中，從而獲得供體菌某些遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化后的受體菌稱為轉(zhuǎn)化子（transformant）供體菌的DNA片段稱為轉(zhuǎn)化因子（transformingprinciple）。發(fā)生轉(zhuǎn)化的條件

菌株之間的親緣關(guān)系（受體和供體染色體的同源性，它決定轉(zhuǎn)化因子的整合）受體細胞必須處于感受態(tài)（competence）受體細胞最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。感受態(tài)細菌吸收DNA的能力比一般細菌大1000倍不論是否處于感受態(tài)，細菌都能吸附DNA，但只有處于感受態(tài)的細菌，吸附的DNA才被吸收不被降解（受體細胞的限制酶系統(tǒng)和其他核酸酶，它們決定轉(zhuǎn)化因子在整合前是否被分解）轉(zhuǎn)化過程轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)通過完全缺陷或部分缺陷噬菌體的媒介，把供體細胞的DNA小片段攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。獲得新遺傳性狀的受體細胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）轉(zhuǎn)導(dǎo)的類型普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)、局限轉(zhuǎn)導(dǎo)、溶源性轉(zhuǎn)變普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）通過完全缺陷噬菌體對供體菌任何小片段的誤包，而實現(xiàn)其遺傳性狀傳遞到受體菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象一般以溫和噬菌體作為媒介完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)流產(chǎn)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)而獲得了供體菌DNA片段的受體菌，如果外源DNA在其內(nèi)既不進行交換、整合和復(fù)制，也不消失，而僅進行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和性狀表達的現(xiàn)象。局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（specializdtransduction）通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。特點只能轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌的個別特定基因（一般為噬菌體整合位點兩側(cè)的基因）特定基因由部分缺陷型噬菌體攜帶低頻“誤切”或雙重溶源菌的裂解而形成。局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)與局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)的區(qū)別區(qū)別要點普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生的時期裂解期溶源期轉(zhuǎn)導(dǎo)的遺傳物質(zhì)供體菌染色體DNA任何部位或質(zhì)粒噬菌體DNA及供體菌DNA的特定部位轉(zhuǎn)導(dǎo)的后果完全轉(zhuǎn)導(dǎo)或流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌獲得供體菌DNA特定部位的遺傳特性轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率受體菌的10-7轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率較普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)增加1000倍(10-4)溶源性轉(zhuǎn)換（lysogenicconversion）當(dāng)噬菌體感染細菌時，宿主菌染色體中獲得了噬菌體的DNA片段，使其成為溶源狀態(tài)時而致細菌獲得新的性狀。原生質(zhì)體融合（protopastfusion)將兩種不同的細菌經(jīng)溶菌酶或青霉素等處理，失去細胞壁成為原生質(zhì)體后進行彼此融合，進而發(fā)生遺傳重組，以產(chǎn)生同時帶有雙親性狀、遺傳性穩(wěn)定融合子的過程。標(biāo)記菌株的篩選→原生質(zhì)體的制備→原生質(zhì)體的融合→原生質(zhì)體的再生→融合子的選擇→優(yōu)良菌種的篩選接合（conjugation）供體菌通過性菌毛傳遞不同長度的單鏈DNA給受體菌，在后者細胞中發(fā)生交換、整合，從而使后者獲得供體菌的遺傳性狀的現(xiàn)象。獲得新性狀的受體細胞稱為接合子。接合性質(zhì)粒能通過接合方式轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒稱為接合性質(zhì)粒，F(xiàn)質(zhì)粒、R質(zhì)粒、Col質(zhì)粒和毒力質(zhì)粒。四種相互聯(lián)系的接合型菌株：F+菌株、F-菌株、F′菌株、Hfr菌株F+×F-F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipientF′×F-F′F′F′F′F′F-F′F-HfrF+F+HfrHfr×F-HfrF-HfrF-HfrF-HfrF-真核微生物的基因重組有性雜交一般指性細胞之間的結(jié)合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。準(zhǔn)性雜交同種生物的兩個不同的體細胞發(fā)生融合，以有絲分裂的方式而導(dǎo)致低頻率的基因重組并產(chǎn)生重組子的雜交方式。有性生殖與準(zhǔn)性生殖的比較項目準(zhǔn)性生殖有性生殖參與接合的親本細胞形態(tài)相同的體細胞形態(tài)或生理有分化的性細胞獨立生活的異核體階段有無接合后雙倍體的細胞形態(tài)與單倍體基本相同與單倍體明顯不同雙倍體變?yōu)閱伪扼w的途徑通過有絲分裂通過減數(shù)分裂接合發(fā)生的幾率偶爾發(fā)現(xiàn)，幾率低正常出現(xiàn)，幾率高第五節(jié)

微生物基因工程基因工程概念基因水平上的遺傳工程將某一生物體的遺傳信息在細胞外與載體相連接，構(gòu)建成一個新的重組DNA分子，然后將其轉(zhuǎn)入另一些生物體細胞中，使引入的供體DNA片段成為受體遺傳物質(zhì)的一部分，其所帶的遺傳信息得以表達或創(chuàng)建出一個新物種。特點體外重組、遠緣雜交、定向性基因工程的主要步驟從供體細胞的DNA中分離限制性內(nèi)切酶酶切特異性DNA片段的PCR擴增以DNA一條鏈為模板，在多聚酶催化下，通過堿基配對使寡核苷酸引物向3′方向延長合成模板的互補鏈。整個過程分三步：變性、退火、延伸PCR引物是PCR過程中與模板DNA部分序列互補，并能引導(dǎo)模板DNA互補鏈合成的一種脫氧核苷酸寡聚體，其3′端必須具有游離的－OH基團。目的基因分離的途徑構(gòu)建cDNA文庫和基因組文庫分離目的基因cDNA文庫（cDNAlibrary）某生物所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA

經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段，再復(fù)制成雙鏈cDNA，與合適的克隆載體連接，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)（轉(zhuǎn)化）轉(zhuǎn)入受體菌，這種包含某生物基因組全部基因cDNA的受體菌群體稱為?；蛭膸欤╣enomicDNAlibrary）存在于轉(zhuǎn)化細菌中、由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合。涵蓋基因組的全部基因信息主要用于真核微生物、動植物中特定基因的克隆由化學(xué)方法合成特定功能的基因DNA合成儀，根據(jù)待合成的DNA片段預(yù)定的核苷酸序列，可自動地將4種核苷酸單體按3′→5′磷酸酯鍵連接成寡核苷酸片段。主要用于結(jié)構(gòu)簡單、核苷酸順序清楚的基因克隆目前常用此方法合成引物、寡核苷酸連桿以及基因片段等。目的基因?qū)胧荏w細胞受體細胞原核生物細胞如大腸桿菌、藍藻等酵母菌、動植物細胞載體載體種類質(zhì)粒載體噬菌體載體根據(jù)特殊要求構(gòu)建的載體載體必須具備的幾個條件必須是一個復(fù)制子，不宜過大；在受體細胞中有較高的復(fù)制率，能穩(wěn)定遺傳；最好只有一個限制性內(nèi)切酶切口，使目的基因能固定的整合到載體DNA的一定位置上；載體上必須有一種選擇性遺傳標(biāo)記，以便及時把極少數(shù)“工程菌”或“工程細胞”選擇出來目的基因組入克隆載體克隆載體的選擇目的基因與載體DNA體外重組限制性內(nèi)切酶處理或人為地連接粘性末端低溫（5~6℃）混合“退火”由于每一種限制性內(nèi)切酶所切斷的雙鏈DNA片段的粘性末端有相同的核苷酸組分，所以二者相混，凡粘性末端上堿基互補的片段通過氫鍵形成雙鏈連接酶使目的基因與載體DNA連接形成重組載體重組DNA分子導(dǎo)入原核生物細胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、三親本雜交轉(zhuǎn)化克隆子的篩選利用抗菌素抗性基因進行篩選利用乳糖操縱子lacZ′基因篩選利用雙酶切片斷重組法初篩利用報告基因篩選克隆子克隆子的鑒定限制性酶切法、分子雜交法、DNA測序法、目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物檢測、目的基因翻譯產(chǎn)物檢測第六節(jié)

微生物菌種保藏及復(fù)壯一、微生物菌種保藏微生物菌種保藏目的妥善保藏使菌不死、不衰、不亂，便于交換使用和研究。原則是盡量降低菌種的代謝活動，隔絕外界影響。原理選典型優(yōu)良純種，最好用休眠體，如分生孢子、芽孢等。創(chuàng)造一適合其長期休眠的環(huán)境條件，如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)等，使微生物生長受抑制，代謝不活潑。選擇菌種保藏方法要考慮的因素保持原菌優(yōu)良性狀不變；方法通用，操作簡便，設(shè)備普及。注意：傳代菌種每一株菌最好保持培養(yǎng)兩個以上；溫度：比正常偏低；接種間隔時間：與培養(yǎng)