基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。第1頁(yè)/共45頁(yè)第一頁(yè)，共46頁(yè)。一、目的基因的獲取(一)、目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的基因請(qǐng)舉出三個(gè)以上的例子（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?1、從基因文庫(kù)中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成請(qǐng)閱讀P8、9第一和二兩段第2頁(yè)/共45頁(yè)第二頁(yè)，共46頁(yè)。一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸?kù)中直接獲取1.基因文庫(kù)：概念見P92.基因文庫(kù)的分類:按外源DNA片段的來(lái)源分類種類基因組DNA文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)3.基因文庫(kù)的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。4.獲取目的基因的根據(jù)：見課本P9第3頁(yè)/共45頁(yè)第三頁(yè)，共46頁(yè)。5.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之一（1）直接分離法(鳥槍法)提取某生物全部DNA用適當(dāng)限制酶切割許多DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物基因組文庫(kù)第4頁(yè)/共45頁(yè)第四頁(yè)，共46頁(yè)。反轉(zhuǎn)錄法：cDNA的合成流程圖解5.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之mRNA與載體連接導(dǎo)入受體菌群逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA(cDNA)該生物cDNA文庫(kù)第5頁(yè)/共45頁(yè)第五頁(yè)，共46頁(yè)?；蚪M文庫(kù)和部分基因組文庫(kù)(cDNA文庫(kù))比較第6頁(yè)/共45頁(yè)第六頁(yè)，共46頁(yè)。1、概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因

因?yàn)檎麄€(gè)過(guò)程是在體外進(jìn)行，所以又叫做體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段2、原理：DNA復(fù)制二、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第7頁(yè)/共45頁(yè)第七頁(yè)，共46頁(yè)。四種脫氧核苷酸(dNTP)

一對(duì)引物：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)

Mg2+(激活劑)3.條件：緩沖溶液一對(duì)寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補(bǔ)一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物4.前提：第8頁(yè)/共45頁(yè)第八頁(yè)，共46頁(yè)。5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G變性復(fù)性延伸1.變性(90---95度)：目的基因DNA受熱變性，解鏈為單鏈；2.復(fù)性（55---60）：引物與兩條單鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合；3.延伸（70---75）：在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，從5′端→3′端進(jìn)行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ5、擴(kuò)增過(guò)程第9頁(yè)/共45頁(yè)第九頁(yè)，共46頁(yè)。2、具體過(guò)程第10頁(yè)/共45頁(yè)第十頁(yè)，共46頁(yè)。PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 第11頁(yè)/共45頁(yè)第十一頁(yè)，共46頁(yè)。①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

_______________、___________、___________.等②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制四種脫氧核苷酸一對(duì)引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）第12頁(yè)/共45頁(yè)第十二頁(yè)，共46頁(yè)。⑥過(guò)程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第13頁(yè)/共45頁(yè)第十三頁(yè)，共46頁(yè)。PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)解旋方式場(chǎng)所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子第14頁(yè)/共45頁(yè)第十四頁(yè)，共46頁(yè)。目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成1）反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測(cè)推測(cè)化學(xué)合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：3、人工合成的目的基因第15頁(yè)/共45頁(yè)第十五頁(yè)，共46頁(yè)。1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。——

核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建第16頁(yè)/共45頁(yè)第十六頁(yè)，共46頁(yè)?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶

目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。第17頁(yè)/共45頁(yè)第十七頁(yè)，共46頁(yè)。

科學(xué)家在培育抗蟲棉時(shí)，經(jīng)過(guò)了許多復(fù)雜的過(guò)程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲能力。資料:第18頁(yè)/共45頁(yè)第十八頁(yè)，共46頁(yè)。2、基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因它們各自的作用是什么?第19頁(yè)/共45頁(yè)第十九頁(yè)，共46頁(yè)。啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)第20頁(yè)/共45頁(yè)第二十頁(yè)，共46頁(yè)。①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意第21頁(yè)/共45頁(yè)第二十一頁(yè)，共46頁(yè)。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)第22頁(yè)/共45頁(yè)第二十二頁(yè)，共46頁(yè)。1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

①農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。第23頁(yè)/共45頁(yè)第二十三頁(yè)，共46頁(yè)。③過(guò)程：④優(yōu)點(diǎn)第24頁(yè)/共45頁(yè)第二十四頁(yè)，共46頁(yè)。（2）基因槍法（3）花粉管通道法第25頁(yè)/共45頁(yè)第二十五頁(yè)，共46頁(yè)。2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞①方法：顯微注射法②程序：目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動(dòng)物第26頁(yè)/共45頁(yè)第二十六頁(yè)，共46頁(yè)。3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少②方法：

用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子第27頁(yè)/共45頁(yè)第二十七頁(yè)，共46頁(yè)。四、目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢查是否成功第28頁(yè)/共45頁(yè)第二十八頁(yè)，共46頁(yè)。（一）、檢測(cè)1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因(關(guān)鍵步驟)①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針③.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過(guò)程:15N15N14N14N探針轉(zhuǎn)基因生物的DNA變性變性第29頁(yè)/共45頁(yè)第二十九頁(yè)，共46頁(yè)。歸納步驟第30頁(yè)/共45頁(yè)第三十頁(yè)，共46頁(yè)。DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。P15思考與探究第31頁(yè)/共45頁(yè)第三十一頁(yè)，共46頁(yè)。（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交②過(guò)程:

用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA第32頁(yè)/共45頁(yè)第三十二頁(yè)，共46頁(yè)。綜上，目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢查是否成功分子水平檢測(cè)—個(gè)體水平鑒定—①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交第33頁(yè)/共45頁(yè)第三十三頁(yè)，共46頁(yè)。小結(jié):基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫(kù)利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：第34頁(yè)/共45頁(yè)第三十四頁(yè)，共46頁(yè)。練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）aa第35頁(yè)/共45頁(yè)第三十五頁(yè)，共46頁(yè)。練習(xí)2：(2008理綜山東卷)為擴(kuò)大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國(guó)科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和

法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用

技術(shù)，該技術(shù)的核心是

和

。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的

作探針進(jìn)行分子雜交檢測(cè)，又要用

方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。基因槍法（花粉管通道法）植物組織培養(yǎng)脫分化和再分化耐鹽基因一定濃度鹽水澆灌第36頁(yè)/共45頁(yè)第三十六頁(yè)，共46頁(yè)。

(2)動(dòng)植物細(xì)胞除去內(nèi)含子第37頁(yè)/共45頁(yè)第三十七頁(yè)，共46頁(yè)。（06年江蘇卷）基因工程又叫基因拼接技術(shù)。（1）在該技術(shù)中，用人工合成方法獲得目的基因的途徑之一是：以目的基因轉(zhuǎn)錄的_____為模板，____成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成______________。

（2）基因工程中常用的受體細(xì)胞有細(xì)菌、真菌、__________。若將真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)該目的基因的基本要求是_____________。（3）假設(shè)以大腸桿菌質(zhì)粒作為運(yùn)載體，并以同一種限制性內(nèi)切酶切割運(yùn)載體與目的基因，將切割后的運(yùn)載體與目的基因片段混合，并加入DNA連接酶。連接產(chǎn)物至少有_______種環(huán)狀DNA分子，它們分別是__________。信使RNA逆轉(zhuǎn)錄

動(dòng)植物細(xì)胞

除去內(nèi)含子

3

運(yùn)載體自連的、目的基因片段自連、運(yùn)載體與目的基因片段相連的環(huán)狀DNA分子

雙鏈DNA（目的基因

第38頁(yè)/共45頁(yè)第三十八頁(yè)，共46頁(yè)。知識(shí)點(diǎn)一：1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子啟動(dòng)子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒(méi)有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來(lái)，使轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶:能夠識(shí)別啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)第39頁(yè)/共45頁(yè)第三十九頁(yè)，共46頁(yè)。①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動(dòng)子終止子第40