實(shí)驗(yàn)五用反膠束萃取技術(shù)提取胰蛋白酶目錄1前言2實(shí)驗(yàn)I3實(shí)驗(yàn)II4結(jié)論5參考文獻(xiàn)1前言反膠束是表面活性劑在有機(jī)溶劑中自發(fā)形成的納米尺度的一種聚集體。表面活性劑是由親水的極性頭和疏水的非極性尾兩部分組成的分子。在反膠束系統(tǒng)中，表面活性劑的非極性尾端指向有機(jī)溶劑，極性頭向內(nèi)排列形成一個(gè)極性核，溶解水后形成“水池”(waterpOOl)。此“水池”可以增溶蛋白質(zhì)等大分子。上世紀(jì)70年代開始，瑞士的Luisi等首次提出了用反膠束萃取蛋白質(zhì)。反膠束萃取具有成本低，可以重復(fù)利用的優(yōu)點(diǎn)，所以具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外對反膠束技術(shù)的研究取得了很大的進(jìn)展。Cortez等用CTAB反膠束體系從季也蒙假絲酵母組織中分離提取木糖還原酶，回收率近100%。Su等從牛乳清中分離得到90%純度的IgG。FerreimMJ使用反膠束萃取技術(shù)成功地從黑曲霉中提取葡萄糖氧化酶。2實(shí)驗(yàn)I反膠束萃取法提取胰蛋白酶的工藝研究2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?.2實(shí)驗(yàn)原理2.3實(shí)驗(yàn)器材與試劑2.4操作步驟2.4.1反膠束相系統(tǒng)的萃取操作1不同pH值對萃取的影響萃取。分別吸取不同pH值的酶溶液和等體積含15%.胰蛋白酶充分轉(zhuǎn)移至反膠束團(tuán)中。離心并測定酶活。將充分混合的?按下式計(jì)算萃取率：萃取率(E)=2不同KCl離子強(qiáng)度對萃取的影響萃取。分別吸取不同KCl濃度的酶溶液和等體積含15%胰蛋白酶充分轉(zhuǎn)移至反膠束團(tuán)中。離心并測定酶活。方法同上。2.4.2反膠束相系統(tǒng)的反萃取操作反萃取。在萃取離心后的上層有機(jī)相?使胰蛋白酶轉(zhuǎn)入水相。離心并測定反萃液酶活。按下式計(jì)算反萃率：反萃率(E'二2.5結(jié)果與討論2.5.2pH值對萃取和反萃取的影響在通常情況下，pH值對反膠束的萃取和反萃皆有很顯著的影響，研究者們也經(jīng)常通過pH值的調(diào)節(jié)以達(dá)到提咼萃取率和反萃取率的目的。蛋白質(zhì)所帶的電荷取決于水相的pH值，從而影響萃取的結(jié)果。由于用的AOT是陰離子表面活性劑，所以只有當(dāng)pH〈pI時(shí)，即胰蛋白酶帶正電，和AOT之間發(fā)生靜電引力作用，胰蛋白酶才能進(jìn)入反膠束相。圖1中可以看出，萃取時(shí)pH值對萃取和反萃取皆有影響。隨著pH值的上升，萃取率是（上升）下降的。當(dāng)dH值為時(shí)，萃取率最咼，為％。當(dāng)pH值達(dá)到時(shí)，萃取率下降到％。這是由于胰蛋白酶的等電點(diǎn)為10.8,在pH〈10.8時(shí)，胰蛋白酶帶正電荷，而AOT是陰離子表面活性劑，所以隨著pH的上升，AOT圖1pH對胰蛋白酶萃取的影響圖1KCl濃度對胰蛋白酶萃取的影響與胰蛋白酶之間的靜電相互作用減弱，萃取率也隨之下降；同樣，雜蛋白也較少地進(jìn)入到反膠束系統(tǒng)，這樣在反萃取過程中更有利于胰蛋白酶進(jìn)入水相。而反萃取時(shí)pH值對反萃取率E'有更為明顯的影響。當(dāng)pH值為5.8時(shí)，反萃取率只有18.3%。隨著pH的上升，E'顯著的上升，當(dāng)pH為時(shí)，E'接近100%。這是由于pH的上升使萃取時(shí)更多的雜蛋白進(jìn)入了反膠束系統(tǒng)，在反萃取過程中，這些等電點(diǎn)低的雜蛋白更易進(jìn)入水相，和胰蛋白酶發(fā)生競爭，所以降低了胰蛋白酶的反萃取率。2.3KCl濃度對萃取和反萃取的影響鹽濃度在反膠束萃取技術(shù)中也是一個(gè)很重要的影響因素。而鹽的濃度對萃取的影響主要是對表面活性劑的表面電荷的屏蔽作用所引起。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。從圖2中可以看出隨著萃取水相KCI濃度的上升，對胰蛋白酶的萃取和反萃取皆有影響。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽濃度過低時(shí)，有機(jī)相和水相不能很好地分層，且蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生變性，產(chǎn)生白色沉淀。當(dāng)［KCl］＞0.04mol/L時(shí),分相變得容易，且蛋白質(zhì)不會(huì)變性失活。E隨著［KCI］的上升而下降，當(dāng)［KCl］為0.04mol/L時(shí)，E為91.7%,而當(dāng)［KCl］上升到0.1mol/L時(shí)，E只有52.3%。這是因?yàn)殡S著離子濃度的增大，反膠束內(nèi)表面的雙電層變薄，于是表面活性劑極性基團(tuán)之間的相互斥力減弱，反膠束的內(nèi)徑也隨之變小，反膠束的增溶水含量也相應(yīng)減少，蛋白質(zhì)不易進(jìn)入反膠束內(nèi)，所以胰蛋白酶的萃取率也隨之下降。隨［KCl］從0.04mol/L上升到0.1mol/L，胰蛋白酶反萃取率是先上升后下降的。在［KCl］=0.06mol/L時(shí)達(dá)到最高，接近100%。綜合萃取和反萃條件,胰蛋白酶的最終得率是在［KCl］=0.06mol/L達(dá)到最大，為88.1%。所以［KCI］=0.06mol/L為萃取胰蛋白酶的最適鹽濃度。3實(shí)驗(yàn)II胰蛋白酶酶活和比活的測定方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髮?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)器材與試劑操作方法將被測酶液用。。。。。。。。。。。。。酶活按下式計(jì)算：C=4結(jié)論綜合各種實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在考慮高得率的情況下，得出最佳的實(shí)驗(yàn)條件為：萃?。核酁?．01mol／LPBS+0．06mol／LKCl，pH7.2緩沖液；反膠束相為0.lmol/LAOT/異辛烷+15%(v/v)ethanol。25°C水浴250r／min轉(zhuǎn)速振蕩5min。反萃?。核?.05NaC03/NaHC03+1.2mol/LKCI+4%ethanol,pillO.1?10.3緩沖液。25C水浴250r/min轉(zhuǎn)速振蕩10min。另外，本實(shí)驗(yàn)大大的簡化了生產(chǎn)步驟，使反膠束技術(shù)在工業(yè)上的應(yīng)用成為了可能，其主要特點(diǎn)是：(1)操作方法簡便，放大容易；(2)分層快速，萃取后分層只需十分鐘左右。不需長時(shí)間靜置或者離心；(3)萃取和反萃取平衡所需時(shí)間都很短，