一、名詞解釋1.生物技術(shù):也稱生物工程（ｂioenｇingineerｉng）,是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理,按照預(yù)先的設(shè)計改造生物體或加工生物原料,為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)成某種目的。2.植物組織培養(yǎng):是指在無菌條件下,把離體的植物器官、組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體等材料接種在人工培養(yǎng)基中，使其發(fā)育成完整植株的過程。3、植物細(xì)胞全能性：任何一個擁有完整細(xì)胞核的植物細(xì)胞都具有形成一個完整植株所必需的所有遺傳信息,在特定條件下表達(dá)可產(chǎn)生獨立的個體。４..脫分化：也叫去分化,已經(jīng)停止分化的細(xì)胞、組織、器官在離體培養(yǎng)條件下，逐漸失去其本來的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)其分生狀態(tài)，形成無組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團的過程。５．再分化：由脫分化產(chǎn)生的無組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團在離體培養(yǎng)條件的剌激下重新分化成具有不同結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞、組織、器官的過程，即再分化。6.培養(yǎng)基:是植物組織培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。其成分是植物生長發(fā)育所必需的各種物質(zhì)的來源,重要涉及營養(yǎng)元素、植物生長調(diào)節(jié)劑、碳源、維生素、有機添加物等。7．外植體：在植物組織培養(yǎng)中，用來進行培養(yǎng)的植物材料常稱外植體(eｘplａｎt）,涉及植物器官、組織、細(xì)胞等。7．重組DNA技術(shù)：是指將一種生物體(供體)的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體)內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNＡ體外操作程序,也稱為分子克隆技術(shù)。8.基因工程：就是將目的基因插入到載體(質(zhì)粒,病毒)中,再把攜帶目的基因的載體轉(zhuǎn)入受體材料細(xì)胞中,使目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)。進而使受體生物表現(xiàn)出目的基因的性狀。=1\*GＢ2＼*ＭERGEFＯRMAＴ⑴限制性核酸內(nèi)切酶：是一類可以辨認(rèn)雙鏈DNA中的特定核苷酸序列，并在特定位點切割雙鏈DNA的內(nèi)切酶。=2\*GB2\*ＭERGEFORMAT⑵平齊末端:當(dāng)限制酶在它辨認(rèn)序列的中心軸線處將DＮA的兩條鏈切開時，產(chǎn)生的則是平末端。=3＼*GB2\*MERGEＦORＭAT⑶粘性末端:當(dāng)限制酶在它辨認(rèn)序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開時,產(chǎn)生的就是黏性末端。=4\*GB2\*MERGEFORMＡＴ⑷同裂酶：能辨認(rèn)同一序列(切割位點可同或不同）但來源不同的兩種酶。=5\*ＧB2＼*ＭERGＥFＯＲMAＴ⑸同尾酶：有些限制性內(nèi)切酶雖然辨認(rèn)序列不完全相同,但切割DNA后,產(chǎn)生相同的黏端，這樣的酶彼此互稱為同尾酶。9.限制性內(nèi)切酶的活性:在適當(dāng)反映條件下，1小時內(nèi)完全酶解1?ｇ特定DNA底物，所需要的限制性內(nèi)切酶的量，為一個活性單位。10.限制性物理圖譜：ＤＮA上某些限制性內(nèi)切酶酶切位點的圖譜，可作為ＤＮA片段的特殊標(biāo)記。也稱ＤNA物理圖譜。11.限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率：切割頻率是指限制性內(nèi)切核酸酶在ＤNA分子中的預(yù)測切點數(shù)。1２.回文序列：雙鏈DNA中的一段倒置反復(fù)序列，當(dāng)該序列的雙鏈被打開后，可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這段序列被稱為回文序列。1３.克隆載體:將外源基因攜帶入宿主細(xì)胞,并在宿主細(xì)胞中進行DNＡ擴增和使外源基因得以高效表達(dá)。１4．表達(dá)載體:在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增長表達(dá)元件（如啟動子、RBS、終止子等)，使目的基因可以表達(dá)的載體。15.目的基因:把需要研究的基因稱為目的基因(靶基因或者插入基因）。要分離、改造、擴增或表達(dá)的基因。１、標(biāo)記輔助選擇（Maｒkeｒ－aｓsistedSｅlecｔion，MAS）:就是對特定的主效基因(majorgene）或者數(shù)量性狀位點（Qｕａntiｔａt(yī)iveTｒａitLoci,QTL）在遺傳標(biāo)記的輔助下區(qū)分其基因型,并在此基礎(chǔ)上應(yīng)用于育種實踐。2、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記:即植物細(xì)胞染色體的變異。涉及染色體核型（染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)、隨體有無、著絲粒位置等)和帶型（C帶、N帶、G帶等）的變化。3、分子標(biāo)記:廣義的分子標(biāo)記(mｏlecuｌarmaｒker）是指可遺傳的并可檢測的DNＡ序列或蛋白質(zhì)。狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記,而這個界定現(xiàn)在被廣泛采納。4.基因組文庫:將目的生物的所有基因組DＮA切割成一定長度的DNＡ片段并克隆到某種載體上而形成的集合。5.ＳNP：單核苷酸多態(tài)性，在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的ＤNA序列多態(tài)性。6．動物細(xì)胞培養(yǎng):是指離體細(xì)胞在無菌條件下進行分裂生長，但是在整個培養(yǎng)過程中細(xì)胞不出現(xiàn)分化，不再形成組織。７.遺傳標(biāo)記:指可追蹤的染色體或染色體上的某一段或某個基因在家系中可傳遞的任何一種遺傳特性,是遺傳多樣性的表達(dá)方法。8．動物生物反映器：運用轉(zhuǎn)基因活體動物，高效表達(dá)某種外源蛋白的器官或組織,進行工業(yè)化生產(chǎn)功能蛋白質(zhì)的技術(shù)。9.共顯性:雜合子的一對等位基因都具有各自的表現(xiàn)效應(yīng)，當(dāng)這一對等位基因雜合時，有兩種表現(xiàn)性共存，便于區(qū)別的純和基因型和雜合基因型。10.cＤNA文庫:是將目的生物某一發(fā)育時期或者是某一組織器官的所有mＲNＡ反轉(zhuǎn)錄成cＤＮＡ并克隆到載體上而形成的集合11．人工種子:是指運用細(xì)胞全能性，將植物離體培養(yǎng)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚或者具有發(fā)育成完整植株能力的分生組織包埋在具有營養(yǎng)物質(zhì)并具有保護能力的外殼內(nèi),形成在適宜條件下能發(fā)芽出苗的顆粒體。１２.胚狀體:指植物組織培養(yǎng)過程中,由非合子細(xì)胞經(jīng)胚胎發(fā)生發(fā)育而形成具有胚狀結(jié)構(gòu),具有發(fā)育成完整植株能力。二，填空1.克隆載體即攜帶目的基因進入宿主細(xì)胞進行復(fù)制或保存的載體,涉及質(zhì)粒載體、噬菌體載體、黏粒載體、工染色體載體2.所有切割雙鏈ＤNA分子中相鄰兩個核苷酸殘基之間磷酸二酯鍵,從而使核酸分子發(fā)生水解斷裂的酶，即核酸酶。根據(jù)其水解方式不同分為外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶，根據(jù)其底物不同又可分為RNA酶和DＮA酶3.細(xì)菌細(xì)胞中的限制行內(nèi)切酶辨認(rèn)位點被甲基化酶保護起來了,限制行內(nèi)切酶對已經(jīng)甲基化的辨認(rèn)位點無效,從而使自身的DNA不被切割。因此,限制行內(nèi)切酶和能辨認(rèn)相同位點的甲基化酶一起構(gòu)成了限制-修飾系統(tǒng)４.Ⅱ型限制性內(nèi)切酶切割雙鏈DNA分子后產(chǎn)生的末端片段,有黏末端和平末端5.Ti質(zhì)粒都具有一下四個區(qū):T-DＮA區(qū),Vｉｒ區(qū),Con區(qū),Ori區(qū)。６.培養(yǎng)基的成分:1.大量元素２.微量元素3.有機成分4．植物生長調(diào)節(jié)劑5．培養(yǎng)基其他成分6．PH值７.母液:指培養(yǎng)基的濃縮液,也稱儲備液，一般將培養(yǎng)基本來配方擴大10倍，20倍,１0０倍甚至更高倍數(shù)，配置母液和培養(yǎng)基一般用純度較高的蒸餾水。簡答題1.AＦLP標(biāo)記技術(shù)原理：由于不同物種的基因組大小不同,基因組ＤNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生的限制性片段的分子量大小不同。使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為擴增反映的模板，用品有選擇性堿基的引物對模板DNA進行擴增,選擇性堿基的種類，數(shù)目和順序決定了擴增片段的特殊性,所以只有那些限制性位點側(cè)翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記,聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,根據(jù)凝膠上DNＡ指紋的有無來檢出多態(tài)性。2.Noｒｔｈeｒn雜交原理:外源基因假如正常表達(dá),在轉(zhuǎn)化植株的細(xì)胞有其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物--－特異mRNＡ生成，提取總RNA或mRNA并進行凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜并與標(biāo)記好的探針雜交形成DNＡ-ＲＮＡ雜合體,通過探針上的標(biāo)記可檢測出目的ｍRＮA。Ｎorｔｈｅrｎ雜交程序：探針制備

探針選擇：檢測外源基因轉(zhuǎn)錄的ｍＲNA應(yīng)使用同源的DNA探針,雜交后形成ＤNA-RＮＡ雜合體;也可使用ｃDNA探針。探針序列的獲得人工合成

PCR方法

質(zhì)粒酶切法

探針標(biāo)記切口平移法②轉(zhuǎn)化植株總RNA的提取。RNA純度的分析:A2６0/A280=1．7—2.0，<1.7,有蛋白質(zhì)或酚污染。A２80/Ａ２３0＞2.0若《2表白有異硫氰酸污染,有異丙醇重新沉淀，ＲNA濃度計算:ＲNA(ug/ml）=Ａ2６0×稀釋倍數(shù)×４0ug/ml分離柱層析法④電泳---甲醛變性電泳

單鏈?zhǔn)筊NA,其鏈內(nèi)堿基易于氫鍵形成二級或三級結(jié)構(gòu)，而甲醛與堿基結(jié)合后形成保持線性，電泳時才與分子量標(biāo)記成正比。⑤轉(zhuǎn)膜-烘膜-雜交-信號檢測-分析結(jié)。3.ｗｅteｒn雜交原理:若目的基因表達(dá)正常,則在轉(zhuǎn)基因植物中具有一定量的目的蛋白。從轉(zhuǎn)基因植物中提取總蛋白質(zhì),兩蛋白質(zhì)樣品溶于去污劑和還原劑的溶液中,經(jīng)ＳDS聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質(zhì)按分子發(fā)小分離，將分離的各蛋白條帶原位轉(zhuǎn)印到固相膜上。膜在高濃度的蛋白質(zhì)中溫育，以封閉非特異位點,加入特異抗體,印記上的目的的蛋白與一抗結(jié)合后，再加入能與一抗專一結(jié)合的標(biāo)記好的二抗，最后痛過二抗上的標(biāo)記化合物的性質(zhì)進行檢出。4.可被運用的遺傳標(biāo)記應(yīng)具有以下幾個條件：多態(tài)性高;表現(xiàn)為共顯性;對農(nóng)藝性狀影響小;經(jīng)濟方便,容易觀測記載。５.基因組文庫：是將目的生物的所有基因組DNA切割成一定長度的ＤＮA片段并克隆到某種載體上而形成的集合。根據(jù)所用載體不同，基因組文庫分為以下幾種。質(zhì)粒文庫，噬菌體文庫，黏粒文庫，人工染色體文庫。6.基因組文庫的構(gòu)建環(huán)節(jié)：1目的植物基因組DNA提取及片段化２載體的選擇與制備3DNA片段與載體連接,噬菌體進行離體包裝4重組體感染宿主細(xì)胞（大腸桿菌)5轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選放射性標(biāo)記探針進行文庫雜交篩選７.mRNA差異顯示技術(shù)分離差異表達(dá)的基因：其基本原型：運用真核生物成熟mRＮＡ的3“ｐolyA結(jié)構(gòu)，用oligo（dT)12MN(其中M為錨定堿基，起增大引物Tｍ值得作用，Ｍ為A，C,G,T中的任意一種）作為描定引物與ｍRNＡ的PLＯＹA結(jié)合,再反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將MRNA反轉(zhuǎn)錄成ｍRNA-cＤNA的雜交分子,這一過程即差異顯示反轉(zhuǎn)錄,然后在用１０ＢP的隨機引物與OLIＨO(DT)12MＮ組成的引物對,以MＲＮＡ－CDＮA為模板進行PCＲ擴增,PＣR產(chǎn)物進行聚丙烯酰氨凝膠電泳,通過放射自顯影或顯色反映即可獲得差異表達(dá)基因的擴增條帶。聚合酶鏈?zhǔn)椒从?在有DＮA單鏈，引物，ＤNTPS、DNA聚合酶等條件下，DNA聚合酶即可從引物開始沿單鏈DNＡ的5”3“合成其互補鏈,而ＰＣR儀可以使這一反映不斷進行下去，直到條件不復(fù)存在。８.ＰCR反映原理:RT-PCR即反轉(zhuǎn)錄PCR,以MRNA為模板,在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,合成CDNA第一鏈的過程。在已知目的基因CDＮA序列的情況下可用此法來分離目的基因。二.高溫高壓滅菌注意事項：1．滅菌鍋提前加入適量的水２.鍋內(nèi)待滅菌的培養(yǎng)基應(yīng)放平不傾倒3.鍋內(nèi)不要裝太滿4,。鍋內(nèi)冷氣要排放出去5．滅菌條件嚴(yán)格控制６．滅菌完畢后,應(yīng)排氣降壓,待壓力表指回0才干打開鍋蓋三.外植體的選擇原則：１再生能力強２.遺傳穩(wěn)定性好3．來源豐富4.滅菌容易5.外植體的大小一.培養(yǎng)基的類型1.含鹽類較高的培養(yǎng)基:MＳ培養(yǎng)基2.硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基:B5Ｎ6SH培養(yǎng)基3.無機鹽中檔含量的培養(yǎng)基：包含H培養(yǎng)基等，適合花藥培養(yǎng)4.無機鹽含量較低的培養(yǎng)基：重要WS培養(yǎng)基等,適合生根培養(yǎng)二．培養(yǎng)基的配置及注意事項1.準(zhǔn)備好稱量的器具，按培養(yǎng)基的配方及所要配置的數(shù)量計算好各成分的分量,取出母液并按順序排好2.在可加熱容器內(nèi)加所配培養(yǎng)基數(shù)量三分之一的蒸餾水，按量加入瓊脂，按計算好的母液分別加入大量元素，微量元素，鐵鹽，有機物,其他物質(zhì)，最后加入適量蔗糖攪拌均勻，生長調(diào)節(jié)劑必須在高溫高壓滅菌后再加入3．加蒸餾水定容，攪拌均勻并做好標(biāo)記4.調(diào)節(jié)ＰH值,常用5．８。5.分裝，注意不要讓培養(yǎng)基沾到內(nèi)壁瓶口,做好標(biāo)記6.封口,培養(yǎng)基分裝好后，一般用硫酸紙，耐高溫塑料蓋，封口膜封口,防止污染。1．人工種子的結(jié)構(gòu)人工種子由胚狀體、人工胚乳和人工種皮三部分組成。胚狀體:涉及組培過程中產(chǎn)生的愈傷組織、頂芽、腋芽、不定芽、原球莖和小鱗莖等繁殖體人工胚乳：一般由供應(yīng)胚狀體養(yǎng)分的膠囊組成其養(yǎng)分重要有礦質(zhì)元素、維生素、碳源、激素等，有時還添加殺蟲劑、殺菌劑、除草劑和一些有益微生物人工種皮:即膠囊之外的薄膜,是人工種子的最外層部分。規(guī)定具有機械保護作用,同時又能通氣,但是又不能使水分和養(yǎng)分外流。２.基因的時空表達(dá)是細(xì)胞分化和個體發(fā)育的主線因素？基因:染色體上具有特定結(jié)構(gòu)和功能的DNA片段。不同基因表達(dá)不同的蛋白質(zhì)，所以不同生物體表現(xiàn)出不同的性狀。即基因決定生物體的性狀,基因一般都包含5’非轉(zhuǎn)錄區(qū)、起始密碼子、轉(zhuǎn)錄區(qū)、終止密碼子、3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)。3.基因的性質(zhì):1:不同的基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)2:基因是可以切割的3：基因是可以轉(zhuǎn)移的４:基因和多肽之間是相應(yīng)的5：遺傳密碼是通用的6:基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給后代6：基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給后代。八、分子標(biāo)記技術(shù)４、分子標(biāo)記特點：=1\＊GＢ3＼*MERGＥFORMAT①直接以DNＡ形式表現(xiàn),在生物體各發(fā)育階段，各組織均可檢測到。與生長發(fā)育無關(guān),取材不受限制；＝2＼*ＧB3＼*ＭＥＲGEＦORMAT②數(shù)量多,信息量大,遍及整個基因組；=3＼＊GB３\*MERGEＦORＭＡＴ③多態(tài)性高,自然界存在許多等位突變，無需專門發(fā)明特殊的遺傳材料;=４＼*ＧB3＼＊MERGＥＦＯＲMAＴ④中性，不影響目的性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然連鎖;=5\*GB3＼*MERGＥFORＭAＴ⑤許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性(ｃodoｍiｎaｎce),可以鑒別出純合基因型與雜合基因型，提供完整的遺傳信息;=6＼＊GB3＼＊MERGEFORMAＴ⑥真核生物中，基因組DNA多態(tài)性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于各種基因的遺傳多態(tài)性,由于基因組中存在著大量的不編碼的ＤNＡ序列,它們的變異不受或較少地受自然選擇的制約.5、ＳSR標(biāo)記的定義及其重要特點定義:也稱微衛(wèi)星或短串聯(lián)反復(fù)序列多態(tài)性（STRＰ)。是運用真核生物基因組中存在的大量簡樸串聯(lián)反復(fù)序列。特點:=1\*GB3＼*MERGEFORMAT①數(shù)量豐富，廣泛分布于整個基因組;人和動物(TG)ｎ,植物(AT）n=2\*GB3\*MERＧEFORMAT②微衛(wèi)星DNA兩端多是高度保守的單拷貝序列，微衛(wèi)星DNA長度的多態(tài)性,具有較多的等位性變異；＝3＼＊ＧB3\＊MＥRＧEＦOＲMAT③共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；1.實現(xiàn)細(xì)胞全能性的兩個條件是什么？=1\*GB3\＊MERGEFORMＡＴ①必須把細(xì)胞從植物體的相應(yīng)部位分離出來。＝2\*GB３\*MＥＲGEFORMAT②必須給予它們適當(dāng)?shù)拇碳?特別是激素的作用。2.配制母液的好處是什么?使用母液可以保證培養(yǎng)基各成分的準(zhǔn)確性,配制及使用的方便性，從而顯著提高工作效率。3.試管苗為什么不能直接移植于大田？由于試管苗的生長環(huán)境不同于自然外界環(huán)境，因此其具有高濕、弱光、恒溫、低透氣性等特點。所以需要馴化后才干移栽。二、基因工程原理：3、重組DNA技術(shù)的三大基本元件：供體、受體、載體。4、基因工程基本用途(意義）=1\*GB3\*MＥRＧＥFＯRMAＴ①分離、擴增、鑒定、研究、整理生物信息資源；＝2\＊GＢ３\*MEＲGEFORMAT②大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)(基因調(diào)節(jié));=3\＊GB3\＊MERGEFORMAT③設(shè)計、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種（正義、反義)5,與形態(tài)學(xué)標(biāo)記,細(xì)胞學(xué)標(biāo)記生化標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有哪些明顯的優(yōu)越性?1直接以DＮA形勢表現(xiàn),在生物體的各個組織,各各個發(fā)育階段均可檢測到,不受季節(jié)，環(huán)境限制,不存在表達(dá)與等問題。２數(shù)量基多，遍布整個基因組,可檢測的座位幾乎是無限的。３多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無需人為發(fā)明。4表現(xiàn)為中性，不影響目的性狀的表達(dá)5許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點,能區(qū)別純合體和雜合體、5、基因克隆中三個基本要點是：基因克隆就是PCR技術(shù),三個基本要點是:=１＼＊GB３\＊MERGＥＦOＲMAＴ①變性（將DNA加熱到90-95度)。＝2\＊GB3\*ＭＥRＧEFOＲＭAT②復(fù)性（將ＤＮＡ降溫至５5-60度)。＝3\＊GB3\＊MERGEFORＭAＴ③延伸(將DNA升溫到7０-75度）?；蚬こ痰幕境绦蛏婕?獲得目的基因——重組質(zhì)粒——構(gòu)建基因工程菌——工程菌大規(guī)模培養(yǎng)——分離提取目的產(chǎn)物。６.作為基因工程載體,必須滿足哪些條件?1可轉(zhuǎn)移性，即能攜帶目的基因進入宿主細(xì)胞。2可自主復(fù)制,能在宿主細(xì)胞中實現(xiàn)目的基因的增值。3多克隆位點，由單一的限制性內(nèi)切酶辨認(rèn)位點組成4合適的選擇標(biāo)記。用于重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞篩選。7、基因工程操作的基本環(huán)節(jié)是什么？＝１\*GB3＼*MＥRＧEFＯRMAT①獲得目的基因(DNA片段)；＝2\*GB3＼*ＭERGＥFORMAＴ②目的基因克?。◤?fù)制)與驗證；=3\*GB3\*MＥRGEＦORＭAT③表達(dá)載體構(gòu)建:將目的基因與載體組合成能在目的生物中表達(dá)的形式（重組DＮA）；=4＼＊GB3\*MＥRＧＥFOＲMＡT④轉(zhuǎn)化:把重組ＤNA引入某種受體生物或細(xì)胞；=５\*GＢ３\*MERGEＦOＲＭＡT⑤篩選:從大量的受體中篩選出也許具有目的基因且目的基因可以表達(dá)的個體或細(xì)胞。一、生物技術(shù)與農(nóng)業(yè):(１)、植物基因工程育種：哺育抗病蟲作物、抗逆育種、抗除草劑育種、品質(zhì)種改良(2）植物細(xì)胞工程１、植物次級代謝細(xì)胞:運用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的植物次生代謝產(chǎn)物涉及藥用成分、香料、色素、殺菌劑等，已經(jīng)成功培養(yǎng)出紫草寧、人參皂苷、紫杉醇、阿馬里新等一系列的天然植物次生代謝物質(zhì),植物次生代謝產(chǎn)品的市場潛能２、快速無性繁殖3、原生質(zhì)體融合4、花粉、花藥和胚的培養(yǎng)5、遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用６、物質(zhì)資源保存(3）生物醫(yī)藥1、我國初次運用除蟲菊成功開發(fā)出無公害農(nóng)藥，2、蘇云金芽孢桿菌是應(yīng)用最廣的殺蟲細(xì)菌3、白僵菌是防止鱗翅目昆蟲的真菌制劑４、昆蟲病毒5、生物肥料(4)動物基因工程育種:動物分子育種技術(shù)重要涉及基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、胚胎工程技術(shù)等(5）動物繁殖新技術(shù)：1、人工授精及精液的冷凍保存2、胚胎移植及胚胎的冷凍保存３、體外胚胎生產(chǎn)４、胚胎分割技術(shù)性別控制技術(shù)5、性別控制技術(shù)(6）1、ＤNA重組生長激素的作用2、運用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)飼料添加劑3、寡糖、寡肽類飼料添加劑或稱益生素（7)動物生物反映器:運用轉(zhuǎn)基因活體動物,高效表達(dá)某種外源蛋白的器官或組織,進行工業(yè)化生產(chǎn)功能蛋白質(zhì)的技術(shù)。重要是乳腺生物反映器未來石油的替代物——乙醇優(yōu)點:產(chǎn)能效率高、燃燒不產(chǎn)生ＣO等有害物質(zhì)污染小、可通過微生物發(fā)酵大量生產(chǎn)成本低。乙醇只要是由酵母菌以蔗糖和淀粉為原料進行發(fā)酵產(chǎn)生的。二、生物技術(shù)與安全:１、對人和動物的潛在危害:致病性、抗藥性、食品安全性2、對生態(tài)環(huán)境的潛在危害:致病性和毒性、生存競爭力、傳播擴散能力、遺傳變異能力、遺傳轉(zhuǎn)移能力3、轉(zhuǎn)基因作物4、生物武器：目前世界上公認(rèn)的對人類危害最大的最易散發(fā)的三種生物武器是:炭疽桿菌、天花病毒、肉毒桿菌。三、工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶2、粘性末端的意義?連接方便:=1\*ＧB３\*MEＲGEＦOＲMAT①不同的DNA雙鏈:只要粘性末端堿基互補可以連接。這比連接兩個平齊末端容易的多。=2\*ＧB3\*ＭEＲGＥFORMＡT②同一個DＮA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。2.影響限制性酶活性的因素有哪些?在酶切反映中，DＮA的純度、緩沖液中的離子強度、Mg2+等因素均可影響反映，一般可通過增加酶的用量,延長反映時間等措施以達(dá)成完全酶切。但應(yīng)當(dāng)注意的是,過多的酶量和過長的反映時間會導(dǎo)致非特異性的酶切(星號活性)。當(dāng)兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時,若要進行雙酶切,應(yīng)采用什么措施?為什么?注意星活性，先低鹽，后高鹽；先低溫酶,后高溫酶;并且可以直接在換酶前將第一種酶失活,再加第二種酶,否則,易產(chǎn)生星活性。或使用通用緩沖液。6、說明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點。用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母，表達(dá)宿主菌的物種名。如大腸桿菌(Esｃherichiacoli）用Ｅｃo表達(dá)。用一個大寫字母表達(dá)菌株或型。如EｃoR。同一宿主菌內(nèi),如有不同的限制酶,用羅馬字母表達(dá)。如EcoRI8、什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號活性：改變反映條件,導(dǎo)致限制酶的專一性和切割效率的改變?受哪些因素的影響?=1\*GB3＼*MＥRGEFORMＡT①DNＡ的純度。＝2\*GB3＼＊ＭEＲＧEＦORMAT②ＤNA的甲基化限度。＝3\*GB３＼*MＥRGＥFORMＡＴ③溫度Ｔｍ。=4\*GB3\＊ＭＥＲGEＦORＭAＴ④緩沖液Ｂｕffｅr。10、計算下列兩種酶各自在某染色體DNＡ序列上辨認(rèn)位點間的平均距離:ＡluI:5’ＡGＣT3，EｃｏＲI:5’ＧＡＡTＴC3’四、工具酶:連接酶與聚合酶１、DNA連接酶的定義:把兩種來源的DＮＡ（用同一種限制酶切割)的黏性末端粘合起來。2、ＤNＡ連接酶連接反映的條件：＝1\*GB3\＊MEＲGＥFORMAＴ①必須是兩條雙鏈DNA。＝２＼*ＧB3②DNA３’端有游離的-OＨ,5’端有一個磷酸基團(P)。=３\*GB3\＊MERＧEFORMAT③需要能量。3、影響DNA連接酶連接反映的因素重要有哪些？=1\＊GB2\*ＭＥRGEFＯＲMＡＴ⑴插入片段與載體的濃度比例。=1\*GB3\*ＭERＧEＦＯRMAT①10～20倍。=2\*GB3\*MERGEＦORMAT②增長插入片段與載體的接觸機會,減少載體自我連接的現(xiàn)象。=2\*GB２＼＊MERGEFＯRMAＴ⑵反映溫度:12．５℃。一般14~16℃。4、ＤNA連接酶的連接機理是什么?=1\*GB3\*ＭERGEFOＲMAT①ＡTP（NAD+）提供激活的AMP一磷酸腺苷。=2\*ＧB３\*MＥＲGEFＯRMAＴ②ＡＴP與連接酶形成共價“連接酶－ＡMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi。=3\＊ＧB3\＊ＭEＲGEFORMAＴ③ＡMＰ與連接酶的賴氨酸-氨基相連。=4＼*GＢ3\*MＥＲGEFORＭAＴ④AMＰ隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移到ＤNA一條鏈的5’端P上，形成“ＤNＡ-腺苷酸”復(fù)合物。=5\*GＢ3\＊MＥRGＥFORＭAT⑤３’-OH對磷原子作親核襲擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP。5、DNＡ連接酶的作用特點有哪些？6、ＤＮA聚合酶的特點：DNＡ聚合酶的特點為需要DNＡ模板、需要RＮＡ或ＤNA做為引物、催化ｄＮＴP加到引物的3′末端。DＮＡ聚合酶以四種三磷酸脫氧核苷為原料，這種酶的共同性質(zhì)是:①需要DNA模板,因此這類酶又稱為依賴DＮA的ＤNA聚合酶(DNaｄepenｄｅntDNApoｌymeraｓe,DDDＰ）。②需要RNA或ＤＮA做為引物（ｐriｍｅr），即DNA聚合酶不能從頭催化DNA的起始。③催化ｄNTP加到引物的3′末端,因而DＮA合成的方向是5′→3′。三種DNA聚合酶都屬于多功能酶,它們在DNA復(fù)制和修復(fù)過程的不同階段發(fā)揮作用。7、DＮA聚合酶與DNA連接酶的異同點?=1＼*GB2\＊MEＲGＥFORMAＴ⑴相同點：催化兩個脫氧核苷酸之間形成磷酸二酯鍵。=2\*GB2\＊MERGＥＦORMAT⑵不同點:=1＼*GB3\*ＭＥＲGEFOＲＭＡＴ①連接酶不需要模板，聚合酶需要DNＡ的一條鏈為模板；＝2\*ＧB3\*MEＲGEFOＲMAT②連接酶的作用對象是游離的DNＡ片段，聚合酶的作用對象是單個的脫氧核苷酸;=3\*ＧB3\*ＭEＲＧEFORＭAＴ③連接酶的作用結(jié)果是形成完整的DNA分子，聚合酶的作用結(jié)果是形成DNA的一條鏈;=4\＊GB３\*MＥRGEFＯＲMＡT④連接酶用于基因工程，聚合酶用于DNA復(fù)制。五、載體與質(zhì)粒：3、克隆載體必須具有什么條件？=1\*GB3＼＊MEＲGEＦORMAT①具有使外源DNA片段插入的限制性酶辨認(rèn)位點（外源性DNA能組入).=２＼*ＧB3②能將外源ＤＮA導(dǎo)入到受體細(xì)胞并進行自我復(fù)制(能繁殖)。=３＼*GB３\*ＭERＧEFＯRMＡT③必須具有選擇標(biāo)記(能篩選出來)。4、基因工程中有三種重要類型的載體：質(zhì)粒型載體、病毒型載體、混合型載體5、ｐUC質(zhì)粒運用α-互補作用篩選重組子原理是什么?(藍(lán)白斑實驗)基因載體上具有?-半乳糖苷酶(LacZ)的基因,當(dāng)外源ＤNA插入到載體的LａcＺ基因上后將導(dǎo)致?－半乳糖苷酶失活，就不能分解培養(yǎng)基中的X－gaｌ(５-溴－4-氯－３-吲哚-?-Ｄ－半乳糖苷)產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，結(jié)果可通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在具有X-ｇal-IPTG（異丙基－?-D－硫代半乳糖苷)培養(yǎng)基的顏色變化直接觀測出來。5、舉例說明什么是穿梭載體?是可以在兩類不同宿主中復(fù)制、增殖和選擇的載體。如有些載體既能在原核細(xì)胞中復(fù)制又能在真核細(xì)胞中復(fù)制,或能在E.ｃolｉ中復(fù)制又能在革蘭氏陽性細(xì)菌中復(fù)制。這類載體重要是質(zhì)粒載體。6、表達(dá)載體必須具有的條件？=1\*ＧB3\*MERGEFＯRＭAＴ①載體可以獨立的復(fù)制;＝2\＊ＧB3＼*MＥRGEＦＯRＭAT②應(yīng)具有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選;=3\*GB3\*ＭERＧEＦORMAT③應(yīng)具有很強的啟動子,能被RNA聚合酶所辨認(rèn)；＝4\*GB3＼*MERGＥＦORMAＴ④應(yīng)具有阻遏子,使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才干進行轉(zhuǎn)錄；=5\*ＧB3\*ＭERＧEFORＭAT⑤應(yīng)具有很強的終止子,以使RＮA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，同時使很強的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定；6、所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號,以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。2、未知基因的獲得途徑?=1\*GB3\*ＭＥRＧEFORMAT①構(gòu)建基因組文庫運用鳥槍法克隆目的基因。=2\*GB3＼*MERGＥFＯＲＭAT②構(gòu)建ｃＤNA文庫,篩選目的基因。=3＼*GB3＼*ＭERGEFORMＡT③ｍRＮA差異顯示技術(shù)篩選差異表達(dá)基因。=4\*GB３\*MERGEFORＭAT④酵母雙雜交體內(nèi)鑒定基因。３、運用用限制性內(nèi)切酶把基因組ＤNA切成不同大小的片斷的優(yōu)點和缺陷？?優(yōu)點：假如帶有粘性末端,產(chǎn)物可以直接與載體連接，連接效率高。缺陷:=1\＊GB３\*MERGEFＯＲMAT①目的基因內(nèi)部也許有內(nèi)切酶的切點，目的基因也被切成碎片。=2\＊GＢ3\*MERGEFORMＡT②消化的片斷分子量太大或太小，不符合載體容量,不能克隆。4、基因組文庫定義？什么是cDNA文庫？同基因組文庫有何差別？=１\*GB2\＊MＥＲＧEFORMAＴ⑴基因組文庫：某種生物的基因組的所有遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌的群體之中,這個群體即為該生物的基因組文庫。=2\*ＧB2＼*MERGEFOＲＭAT⑵cＤNA文庫：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的的所有ｍRＮA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA分別與克隆載體重組，貯存在一個受體菌的群體中，這個群體就稱為cDNＡ文庫。=3\*ＧＢ2\*ＭERGEFＯRMＡT⑶區(qū)別：＝1\*GB2\*MERＧＥFORMＡT⑴克隆均一性:ｃＤNA文庫大小不一，基因組文庫大小基本一致。=2\*ＧB2\*MEＲＧＥFORMＡT⑵基因覆蓋率：ｃDNA文庫包含部分基因,基因組文庫包含所有基因。5、構(gòu)建基因組文庫時連接方法重要是粘性末端連接法;而構(gòu)建ｃDNＡ文庫，可用接尾連接法或人工接頭連接法。6、構(gòu)建ｃＤＮＡ文庫的一般環(huán)節(jié)?=1\*ＧB3\＊MERＧEＦORMAT①細(xì)胞總DNA的提取和ｍRNＡ的分離。=2\*ＧB3\*MERGＥＦORＭAT②第一鏈cDNA合成。=3\＊ＧB3\*MERＧEFOＲＭAT③第二鏈cDNＡ合成。=4\＊GB３＼*MERGEFORMＡT④雙鏈cDＮA的分級分離。=5\*GB3＼*ＭEＲGEFOＲMＡT⑤雙鏈cDNA克隆進質(zhì)粒或噬菌體載體并導(dǎo)入宿主中繁殖。=６＼*GB3\*MＥＲGＥFORMAＴ⑥重組體的篩選與鑒定。分離基因文庫中目的基因的方法有：核酸雜交法、差別雜交篩選、mＲＮA差別顯示法、酵母雙雜交篩選法（建立了一個基因文庫后，如何鑒定一個攜帶目的基因的克隆？)用目的基因制作一個引物,進行pｃr擴增就知道究竟克隆載體是否帶有目的基因片段了。七、轉(zhuǎn)基因育種1、作物轉(zhuǎn)基因育種定義及其優(yōu)勢：優(yōu)勢:=1＼*ＧB3\*MEＲＧEＦORMAT①拓寬可運用的基因資源;=２\*GB3\＊MERGEFORMAT②哺育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗優(yōu)良品種提供了嶄新的育種途徑；=3\＊ＧＢ3＼*MERGEFORMAT③可以對植物的目的性狀進行定向變異和定向選擇；=４＼*ＧＢ3＼*MERＧＥFＯＲMAT④可以大大提高選擇效率，加快育種進程。=5\*ＧB3\＊MEＲGＥFORMＡT⑤此外,還可將植物作為生物反映器生產(chǎn)藥物等生物制品2、定義:就是根據(jù)育種目的，從供體生物中分離目的基因，經(jīng)DＮA重組與遺傳轉(zhuǎn)化或直接運載進入受體作物，通過篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的遺傳工程體，并通過田間實驗與大田選擇育成轉(zhuǎn)基因新品種或種質(zhì)資源。3、植物遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體有哪兩大類?＝1＼＊GB3\*MＥRGEFORMAT①質(zhì)粒載體系統(tǒng);＝２\＊GB３\*ＭＥRGEFＯＲＭAＴ②病毒載體系統(tǒng)。４、一元載體系統(tǒng);雙元載體系統(tǒng)定義;兩者的不同一元載體系統(tǒng)(整合載體系統(tǒng)):這一類載體系統(tǒng)由外源基因表達(dá)結(jié)構(gòu)和改造后的卸甲(去掉致瘤基因,disarmed)Ｔｉ質(zhì)粒組成。在農(nóng)桿菌內(nèi),通過同源重組將外源基因整合到修飾過的T-DＮA上，形成可穿梭的共整合載體,在Vir基因產(chǎn)物的作用下完畢目的基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和整合。但這類方法構(gòu)建困難，整合體形成率低。雙元載體系統(tǒng)：它由兩個分別具有T-ＤＮA和Vｉｒ區(qū)的相容性突變Tｉ質(zhì)粒即：微型Ｔi質(zhì)粒（mini-Tｉpｌasｍid,相稱于Ｔ-DNＡ)、輔助Ti質(zhì)粒(hｅlｐerＴiplａsmiｄ，相稱于vir區(qū))