熒光定量PCR原理及應(yīng)用第一頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基本原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR就是通過對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。第二頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖.第三頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日熒光擴(kuò)增曲線分為三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。第四頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日熒光背景信號(hào)階段：為擴(kuò)增最初的10～15個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。平臺(tái)期：擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。第五頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日指數(shù)期：此期PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，因此我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和CT值。第六頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日熒光閾值：是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。CT值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值。第七頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，到達(dá)熒光閾值的CT值越小，反之越大。第八頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，橫坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。第九頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日

定量方法絕對(duì)定量：是用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同的條件下目的基因測(cè)得的熒光信號(hào)量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而得到目的基因的量。第十頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日相對(duì)定量：是通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計(jì)算表達(dá)基因的差異，也稱之為2-ΔΔCt。第十一頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日

其他定量方法第十二頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日

熒光定量PCR檢測(cè)模式熒光定量PCR的理論基礎(chǔ)：均基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)的原理，即當(dāng)一個(gè)熒光基團(tuán)與一個(gè)淬滅基團(tuán)的距離鄰近時(shí)（＜10nm)，就會(huì)發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，淬滅基團(tuán)會(huì)吸收熒光基團(tuán)在激發(fā)光作用下的激發(fā)熒光，從而使其發(fā)不出熒光。但如果熒光基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)分開，淬滅作用即消失。第十三頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日檢測(cè)模式SYBRGreenI檢測(cè)模式：SYBRGreenI是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料。與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。第十四頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBRGreenI工作原理第十五頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日缺點(diǎn)：PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會(huì)產(chǎn)生熒光，通常本底較高，引起假陽(yáng)性。優(yōu)點(diǎn)：通用性好，價(jià)格低，在科研中使用較普遍。第十六頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日水解探針模式（Taqman）TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的5’外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。第十七頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子熒光信號(hào)的產(chǎn)生，隨著循環(huán)數(shù)增加，熒光信號(hào)不斷積累。第十八頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日分子信標(biāo)探針模式分子信標(biāo)是一種在靶DNA不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般5-7個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端，而淬滅劑則連接于另一端。第十九頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日模板不存在時(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)緊緊靠近而被淬滅。當(dāng)存在模板時(shí)，環(huán)序列將與模板配對(duì)，此時(shí)分子信標(biāo)成鏈狀而非莖環(huán)狀，熒光基團(tuán)與淬滅劑分開，使得熒光基團(tuán)發(fā)出熒光。第二十頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日其它還有雙雜交探針、蝎形探針、LUXPrimers等模式。第二十一頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日

引物設(shè)計(jì)原則引物最適長(zhǎng)度為15～20bp.G+C含量為40～60%。引物的Tm值應(yīng)相似，差異不超過1～2℃.產(chǎn)物長(zhǎng)度在80～150bp.不能形成引物二聚體。第二十二頁(yè)，共二十三