蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)第一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)（Protein）“生命是蛋白體的存在方式，這種存在方式本質(zhì)上就在于這些蛋白體的化學(xué)組成部分的不斷的自我更新。”

——恩格斯《反杜林論》1878年1838年，J.J.Berzelius提出，由proteios衍生而來，——第一重要，首要的物質(zhì)第二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)存在于所有生物細(xì)胞中，是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與了幾乎所有的生命活動(dòng)過程。第三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日一、蛋白質(zhì)通論（一）、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類１、元素組成蛋白質(zhì)是一類含氮有機(jī)化合物

第四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日２、蛋白質(zhì)的含氮量蛋白氮占生物組織所有含氮物質(zhì)的絕大部分。大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量接近于16%

蛋白質(zhì)含量=每克樣品中含氮的克數(shù)6.25凱氏定氮法第六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日三聚氰胺含氮量：66.7%含氮量是蛋白質(zhì)的4.16倍。第七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日３、蛋白質(zhì)的分類（1）、依據(jù)外形分類球狀蛋白質(zhì)：globularprotein

外形接近球形或橢圓形，溶解性較好纖維狀蛋白質(zhì)：fibrousprotein

形似纖維或細(xì)棒，分可溶性/不溶性兩種膜蛋白質(zhì)：membraneprotein

親水性殘基少于胞質(zhì)蛋白第八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（2）、依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分類單純蛋白

simpleprotein

單純蛋白，僅由氨基酸組成綴合蛋白

conjugatedprotein由簡(jiǎn)單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成第九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日單

純

蛋

白清蛋白和球蛋白

albuminandglobulin

廣泛存在于動(dòng)物組織谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin

植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/堿魚精蛋白和組蛋白堿性蛋白存在于細(xì)胞核硬蛋白存在于軟骨、腱、毛發(fā)、絲等組織中，分為角/膠原/彈性/和絲蛋白等第十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日綴

合

蛋

白糖蛋白：簡(jiǎn)單蛋白+糖類物質(zhì)脂蛋白：簡(jiǎn)單蛋白+脂類結(jié)合核蛋白：簡(jiǎn)單蛋白+核酸磷蛋白：含與Ser,Thr和Tyr殘基的羥基酯化的磷酸基。金屬蛋白：含有金屬離子的蛋白質(zhì)血紅素蛋白：金屬蛋白的一個(gè)亞類；輔基為血紅素，是卟啉化合物。黃素蛋白：含黃素，輔基為FMN和FAD。第十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（3）蛋白質(zhì)按生物學(xué)功能分類酶：如核糖核酸酶，胰蛋白酶等調(diào)節(jié)因子：如胰島素、促生長素、促甲狀腺素等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：如血紅蛋白、血清清蛋白、和葡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貯存蛋白：如卵清蛋白、酪蛋白、菜豆蛋白和鐵蛋白收縮和游動(dòng)蛋白：肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、動(dòng)力蛋白結(jié)構(gòu)蛋白：角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白、絲蛋白和蛋白聚糖支架蛋白：如胰島素受體底物-1、A激酶錨定蛋白和信號(hào)傳遞轉(zhuǎn)錄激活劑保護(hù)和開發(fā)蛋白：如免疫球蛋白、凝血酶、血纖蛋白原、抗凍蛋白、蛇和蜂毒蛋白、白喉毒素等異常蛋白：如應(yīng)樂果甜蛋白、節(jié)肢彈性蛋白和膠質(zhì)蛋白第十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（二）、蛋白質(zhì)的大小與分子量蛋白質(zhì)是分子量很大的生物分子對(duì)任一種給定的蛋白質(zhì)，其所有分子在AA組成和順序以及肽鏈的長度方面都應(yīng)是相同的，即所謂均一的蛋白質(zhì)。第十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日人為規(guī)定Pr分子量上下限下限一般認(rèn)為從胰島素開始，其相對(duì)分子量為5700（51個(gè)氨基酸殘基）某些Pr由兩至多個(gè)亞基經(jīng)非共價(jià)結(jié)合而成（寡聚蛋白）分子量高達(dá)數(shù)百/千萬。如谷酰胺合成酶（12個(gè)亞基組成），如煙草花葉病毒（2130個(gè)亞基和一條RNA鏈構(gòu)成。第十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)與多肽無嚴(yán)格的界線

——通常將6000Dr以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大蛋白質(zhì)——月示——胨——多肽——肽——AA1*1045*1032*1031000200100-500對(duì)于不含輔基的單純蛋白質(zhì)，相對(duì)分子量/110≈aa殘基數(shù)20種aa的平均分子量約為138，較小的氨基酸占優(yōu)勢(shì)，因此平均分子質(zhì)量為128。形成一個(gè)肽鍵失去一分子水（分子量18），aa殘基的平均分子量為110。100個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子量約為多少？第十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（三）、蛋白質(zhì)構(gòu)象和結(jié)構(gòu)的組織層次蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)高級(jí)結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象第十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的各級(jí)結(jié)構(gòu)的基本概念一級(jí)（1o）結(jié)構(gòu)：肽鏈中的氨基酸排列順序。二級(jí)（2o）結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助氫鍵排列成自己特有的a螺旋和b折疊股片段。三級(jí)（3o）結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助各種非共價(jià)鍵（非共價(jià)力）彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀構(gòu)象。四級(jí)（4o）結(jié)構(gòu)：寡聚蛋白質(zhì)中各亞基之間在空間上的相互關(guān)系和結(jié)合方式。一個(gè)蛋白質(zhì)分子為獲得復(fù)雜結(jié)構(gòu)所需的全部信息都含于1o結(jié)構(gòu)即多肽鏈的氨基酸序列中第十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日示例第十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日肌紅蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)和丙酮磷酸異構(gòu)酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)第二十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日血紅蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)第二十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（四）、蛋白質(zhì)功能的多樣性1.催化功能-酶2.調(diào)節(jié)功能-激素、基因調(diào)控因子3.轉(zhuǎn)運(yùn)功能-膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、血紅/血清蛋白4.貯存功能-乳、蛋、谷蛋白5.運(yùn)動(dòng)功能-鞭毛、肌肉蛋白6.結(jié)構(gòu)成分-皮、毛、骨、牙、細(xì)胞骨架7.支架作用-接頭蛋白8.防御功能-免疫球蛋白9.異常功能第二十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第二十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日生老病死，萬物輪回(蛋白質(zhì)層次)生（誕生、生長）：在酶催化下老細(xì)胞計(jì)劃性凋亡和新細(xì)胞的再生（新陳代謝）、活細(xì)胞的代謝老？蛋白質(zhì)功能普遍衰退(?)病—個(gè)別蛋白質(zhì)的功能障礙死？蛋白質(zhì)功能的全部停止/分解

蛋白質(zhì)——生物功能分子第二十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日單細(xì)胞生物胞外酶鞭毛-蛋白質(zhì)（運(yùn)動(dòng)器官）細(xì)胞壁-糖、脂、肽細(xì)胞膜-載運(yùn)蛋白、膜蛋白細(xì)胞質(zhì)-酶蛋白（催化物質(zhì)代謝）細(xì)胞核-酶蛋白（遺傳）第二十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日多細(xì)胞動(dòng)物個(gè)體層次毛發(fā)、皮膚

-角蛋白骨骼、牙齒

-鈣+膠原蛋白肌肉

-肌球蛋白/肌絲蛋白第二十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日二、肽（peptide）AA-NH2與另一AA-COOH間失水形成的酰胺鍵稱肽鍵，所形成的化合物稱肽。第二十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第二十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日由兩個(gè)AA組成的肽稱為二肽。含幾個(gè)至十幾個(gè)AA的肽鏈稱為寡肽由20個(gè)AA以上組成的肽則稱為多肽。組成多肽的AA單元稱為氨基酸殘基。第二十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日多肽鏈中AA殘基按一定順序排列：氨基酸順序含游離-氨基的一端：氨基端或N-端含游離-羧基的一端：羧基端或C-端AA順序是從N-端開始以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln反過來寫的是一個(gè)不同的肽第三十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日肽鍵是aa間的基本連接方式。證據(jù)：１、Pr中游離α－氨基和α－羧基很少。２、人工合成的多肽能被蛋白酶水解。３、Pr能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)（紫紅色或藍(lán)紫色）４、人工合成的多聚aa的Ｘ－射線衍射圖案和紅外吸收光譜與天然的纖維狀蛋白質(zhì)十分相似。５、我國首次人工合成－結(jié)晶牛胰島素。第三十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（一）、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽鍵的特點(diǎn)是：——N上孤對(duì)電子與羰基有明顯的共軛作用。第三十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日①肽鍵中C-N鍵有部分雙鍵性質(zhì)

——不能自由旋轉(zhuǎn)②組成肽鍵原子處于同一平面（肽平面）③鍵長及鍵角一定④大多數(shù)情況以反式結(jié)構(gòu)存在第三十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日共價(jià)主鏈

第三十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（二）、肽的物理化學(xué)性質(zhì)離子晶格，在水溶液中以偶極離子存在。肽末端α-羧基pKa值比游離AA中的大。肽末端α-氨基pKa值比游離AA中的小。酸堿性質(zhì)取決于：

—α-羧基、α-氨基、側(cè)鏈基團(tuán)的解離等電點(diǎn)，靜電荷為零時(shí)溶液的pH值。肽的化學(xué)反應(yīng)也和AA一樣，游離的α-羧基、α-氨基、側(cè)鏈基團(tuán)可以發(fā)生類似AA的反應(yīng)，如茚三酮反應(yīng)。具有雙縮脲反應(yīng)—肽特有的反應(yīng)。（紫紅色或藍(lán)紫色）第三十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（三）、天然存在的活性肽生物體中多肽最重要的存在形式是作為蛋白質(zhì)的亞單位；有許多分子量比較小的寡（多）肽以游離狀態(tài)存在，這類肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽、激素類多肽、抗生素類多肽、

谷胱甘肽、蛇毒多肽等第三十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-腦啡肽

Leu-腦啡肽第三十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日

L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val

L-OrnL-Orn

L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu

短桿菌肽S(環(huán)十肽)

由細(xì)菌分泌，含有D-AA和一些不常見AA，如鳥氨酸（Ornithine,Orn）。

第三十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日鵝膏覃堿是一種環(huán)狀八肽，真核生物RNA聚合酶II的抑制劑（能與RNA聚合酶緊緊結(jié)合）第三十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第四十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日三、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定蛋白質(zhì)AA順序測(cè)定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)1953年F.Sanger測(cè)定了胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)現(xiàn)已有成千上萬種不同蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)被測(cè)定。

什么是Pr的一級(jí)結(jié)構(gòu)？蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。第四十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第四十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日1.樣品必需純（>97%以上）2.知道蛋白質(zhì)的分子量3.知道蛋白質(zhì)由幾個(gè)亞基組成4.測(cè)定蛋白質(zhì)的AA組成并根據(jù)分子量計(jì)算每種AA的個(gè)數(shù)5.測(cè)定水解液中的氨量計(jì)算酰胺的含量蛋白質(zhì)測(cè)序前提第四十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(1)測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目通過測(cè)定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定第四十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(2)

多肽鏈的拆分蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定第四十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質(zhì)，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體。可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基)。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定第四十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(3)

斷開二硫鍵在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護(hù)生成的巰基，防止重新被氧化。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定第四十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第四十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日巰基（-SH）的保護(hù)第四十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定(4)測(cè)定每條多肽鏈的AA組成，并計(jì)算出AA成分的分子比部分樣品進(jìn)行完全水解，測(cè)定氨基酸組成第五十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第五十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端(6)多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段采用兩/多種不同的斷裂方法將多肽

斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定第五十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略(7)測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定(8)確定肽段在多肽鏈中的次序

利用兩/多套肽段的AA順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的AA順序。第五十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。（一）、蛋白質(zhì)測(cè)序策略蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定胃蛋白酶水解第五十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日兩類多肽鏈末端氨基酸殘基：

N-端氨基酸

C-端氨基酸在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸殘基測(cè)定第五十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日Sanger法1、末端分析

二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+

H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸（二）、末端氨基酸殘基的鑒定N堿性條件二硝基苯衍生物黃色第五十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日二甲氨基萘磺酰-AA有強(qiáng)熒光，檢測(cè)靈敏度高

丹磺酰氯（DNS）法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N堿性條件(DNS-aa)第五十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日苯異硫氰酸酯（PITC)法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N第五十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日—N=C=S+N—CH—CO—NH—C·······HHR1PITC—N—C—N—CH—CO—NH—C·······HHRSPTC-多肽—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF苯異硫氰酸酯PITCR2多肽+N—CH—CO—NH—C·······HHR2R3少一個(gè)氨基酸的多肽第五十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日肽鏈外切酶:從多肽鏈N-端逐個(gè)向里水解根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間測(cè)出釋放的AA種類和數(shù)量，

按反應(yīng)時(shí)間和AA殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線

蛋白質(zhì)N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶

—水解以Leu殘基為N-末端的肽鍵速度最大。④氨肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N第六十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日氨基酸酰肼可與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)。上清中的氨基酸可通過其他方法鑒定①

肼解法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2C1～n-1第六十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2C

C末端AAα氨基醇水解肽鏈，鑒定α氨基醇②

還原法硼氫化鋰第六十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日肽鏈外切酶:從多肽鏈C-端逐個(gè)水解根據(jù)不同反應(yīng)時(shí)間釋放出的AA種類和數(shù)量

蛋白質(zhì)C-末端殘基順序。四種羧肽酶：A,B,C和Y；

A和B(胰臟)、C(柑桔葉)、Y(面包酵母)∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA殘基∽B:只水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵∽Y：可作用于任何一個(gè)C-末端殘基的肽鍵③羧肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2C第六十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（三）、二硫鍵的斷裂鹽酸胍/尿素解離多肽鏈間的非共價(jià)力。應(yīng)用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。第六十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日1、酸水解常用6M鹽酸或4M硫酸優(yōu)點(diǎn)：水解產(chǎn)物不消旋缺點(diǎn)：Trp被沸酸完全破壞含羥基Ser、Thr、Tyr部分分解

Asn、Gln酰胺基被水解（四）、氨基酸組成的分析第六十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日2、堿水解一般用5M氫氧化鈉缺點(diǎn)：許多AA受到不同程度的破壞部分水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化優(yōu)點(diǎn)：Trp不受破壞（四）、氨基酸組成的分析第六十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日1、酶解法:內(nèi)切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解

（五）、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化目前序列分析方法最長只能幾十個(gè)殘基，因此需要裂解多肽，然后分離純化。第六十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日R1=Lys（K）或Arg（R）專一性較強(qiáng)，水解速度快R2=Pro（抑制）肽鏈水解位點(diǎn)胰蛋白酶trypsin減少斷裂點(diǎn)：保護(hù)Lys側(cè)鏈ε-NH2或修飾Arg胍基增加斷裂點(diǎn)：將Cys變?yōu)轭愃芁ys的結(jié)構(gòu)第六十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AALeu、Met和His稍慢R2=Pro（抑制）pH8-9肽鏈水解位點(diǎn)糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度與相鄰AA性質(zhì)有關(guān):酸性：-/堿性：+第六十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性強(qiáng)的AA水解速度較快肽鏈水解位點(diǎn)R2=Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解嗜熱菌蛋白酶（thermolysin)第七十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度較快

R1=Pro（抑制）pH2肽鏈水解位點(diǎn)胃蛋白酶Pepsin第七十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日肽鏈水解位點(diǎn)羧肽酶和氨肽酶第七十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日2、化學(xué)裂解法

①溴化氰水解法(Cyanogenbromide)——選擇性地切割由Met羧基形成的肽鍵。（五）、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化多肽鏈的選擇性降解第七十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日

②NH2OH斷裂：較專一性斷裂Asn-Gly之間的肽鍵

Asn-Leu及Asn-Ala鍵也能部分?jǐn)嗔?/p>

第七十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日3、肽段的分離純化：

凝膠過濾、凝膠電泳和HPLC法第七十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日N-端分析法

特點(diǎn)：能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。

1、Edman法（六）、肽段氨基酸序列的測(cè)定（苯異硫氰酸酯法）Edman于1950年首先提出。第七十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日無水氨基非質(zhì)子化PITCPTC-肽第七十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第七十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第七十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日2、氨肽酶法或羧肽酶法3、質(zhì)譜法（MS）

靈敏度高、所需樣品少、測(cè)定速度快第八十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第八十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第八十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第八十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第八十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日核糖體蛋白質(zhì)鏈4.根據(jù)核苷酸序列的推定法第八十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日根據(jù)核苷酸序列的推定法：（1）用待測(cè)的蛋白質(zhì)作抗原免疫動(dòng)物抗體（2）分離多核糖體（3）抗體沉淀此種蛋白質(zhì)多核糖體（4）分離該蛋白質(zhì)的模板mRNA，（5）反轉(zhuǎn)錄成cDNA（6）根據(jù)測(cè)定cDNA序列推測(cè)蛋白質(zhì)的AA序列。注意：必須知道蛋白質(zhì)N-末端和C-末端氨基酸殘基第八十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（七）、肽段在多肽鏈中次序的決定重疊肽（overlapingpeptide）第八十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈經(jīng)電泳分離各肽段用過甲酸斷開二硫鍵，含有-S-S-的肽段帶電性質(zhì)發(fā)生變化，轉(zhuǎn)向90℃二次電泳，曾含二硫鍵的肽段遷移率發(fā)生變化然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置（八）、二硫鍵位置的確定第八十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日胃蛋白酶最適pH約2，此時(shí)二硫鍵不斷開專一性低、肽段短第八十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（九）、蛋白質(zhì)測(cè)序舉例第九十頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（十）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫

www.ncbi.nlm.第九十一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日

同源蛋白質(zhì)：來自不同生物體、

執(zhí)行同一/相似功能的蛋白質(zhì)

同種蛋白質(zhì)：來自相同生物體、

執(zhí)行同一功能的蛋白質(zhì)

同源蛋白質(zhì)的AA序列具有明顯的相似性

——序列同源性（sequencehomology）

不變殘基/可變殘基1、同源蛋白質(zhì)四、蛋白質(zhì)的AA序列與生物功能（一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進(jìn)化第九十二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日

一百多個(gè)AA殘基

MW約12.5×103

28個(gè)不變殘基

序列間AA差異數(shù)與物種間系統(tǒng)發(fā)生差異成比例；

進(jìn)化位置上相差愈遠(yuǎn)，AA序列之間的差別愈大。

細(xì)胞色素C的AA序列差異可用于核對(duì)各物種間的分類學(xué)關(guān)系以及繪制系統(tǒng)樹/進(jìn)化樹。

2、細(xì)胞色素C與系統(tǒng)樹第九十三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日invariantresidues(yellow)conservativesubstitutions(blue)nonconservativeorvariableresidues(unshaded)Conservationandvariationofcytochromecsequences第九十四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第九十五頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第九十六頁，共一百零八頁，2022年，8月28日

序列同源關(guān)系表明隨機(jī)突變導(dǎo)致一級(jí)結(jié)構(gòu)方面AA取代/趨異事件的進(jìn)化順序。

1、氧合血紅蛋白（二）同源蛋白質(zhì)具有共同的進(jìn)化起源第九十七頁，共一百零八頁，2022年，8月28日該酶類活性中心的Ser殘基起關(guān)鍵作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶和纖溶酶有序列同源性對(duì)底物偏愛不同2、絲氨酸蛋白酶類第九十八頁，共一百零八頁，2022年，8月28日卵清中的溶菌酶（lysozyme）α-乳清蛋白（lactalbumin）——三級(jí)結(jié)構(gòu)很相似也可能具有共同的祖先。3、一些功能差異很大的蛋白質(zhì)第九十九頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（三）血液凝固與AA序列的局部斷裂

凝血酶原血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纖蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘难w蛋白網(wǎng)?？扇苄缘难w蛋白原酶有活性的凝血酶不溶性的血纖蛋白網(wǎng)第一百頁，共一百零八頁，2022年，8月28日第一百零一頁，共一百零八頁，2022年，8月28日（一）肽的人工合成

保護(hù)（氨基、羧基、側(cè)鏈活性基團(tuán)）

活化（氨基、羧基）

縮合劑

（二）胰島素的人工合成

（三）固相肽合成五、肽與蛋白質(zhì)的人工合成第一百零二頁，共一百零八頁，2022年，8月28日樹脂掛接第一百零三頁，共一百零八頁，2022年，8月28日1.有一多肽經(jīng)酸水解后產(chǎn)生等摩爾的Lys，Gly和A1a.如用胰蛋白酶水解該肽，僅發(fā)現(xiàn)有游離的Gly和一種二肽。下列多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，哪一個(gè)符合該肽的結(jié)構(gòu)?A.Gly-Lys-Ala-Lys-Gly-AlaB.Ala-Lys-GlyC.Lys-Gly-AlaD.Gly-Lys-AlaE.Ala-Gly-Lys

2.測(cè)定小肽氨基酸順序的最好方法是

A.2，4-二硝基氟苯法(FDNB法)B.二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-Cl法)C.氨肽酶法

D.苯異硫氰酸法(PITC法)E.羧肽酶法

選擇題第一百零四頁，共一百零八頁，2022年，8月28日3.用下列方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，哪一種方法需要完整的肽鍵?A.雙縮脲反應(yīng)

B.