DNA測序原理和方法DNA序列測定分手工測序和自動測序，手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學降解法。自動化測序實際上已成為當今DNA序列分析的主流。美國PEABI公司已生產(chǎn)出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA測序儀，其中310型是臨床檢測實驗室中使用最多的一種型號。本實驗介紹的是ABIPRISM310型DNA測序儀的測序原理和操作規(guī)程。【原理】ABIPRISM310型基因分析儀(即DNA測序儀)，采用毛細管電泳技術取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應用該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個堿基的3""末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數(shù)窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉變?yōu)镈NA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動數(shù)據(jù)收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠(POP6)和GeneScan膠(POP4)。這些凝膠顆?？讖骄唬苊饬伺淠z條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟件。它使用最新的CCD攝影機檢測器，使DNA測序縮短至，PCR片段大小分析和定量分析為10?40min。由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規(guī)DNA測序外，還可進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等?！驹噭┡c器材】BigDye測序反應試劑盒主要試劑是BigDyeMix,內含PE專利四色熒光標記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaqDNApolymeraseFS，反應緩沖液等。pGEM-3Zf(+)雙鏈DNA對照模板L，試劑盒配套試劑。M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，gmol/L，即皿，試劑盒配套試劑。DNA測序模板可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質粒DNA等。模板濃度應調整在PCR反應時取量1皿為宜。本實驗測定的質粒DNA，濃度為L，即200ng/M。引物需根據(jù)所要測定的DNA片段設計正向或反向引物，配制成gmol/L，即皿。如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物，女口M13(-21)引物，T7引物等。滅菌去離子水或三蒸水?；蚝偷腜CR管蓋體分離，PE公司產(chǎn)品。3mol/L醋酸鈉稱取NaAc?3H2O溶于70ml蒸餾水中，冰醋酸調pH至，定容至100ml，高壓滅菌后分裝。70%乙醇和無水乙醇。NaAc/乙醇混合液取無水乙醇和3mol/LNaAc混勻，室溫可保存1年。POP6測序膠ABI產(chǎn)品。12?模板抑制試劑(TSR)ABI產(chǎn)品。10x電泳緩沖液ABI產(chǎn)品。ABIPRISM310型全自動DNA測序儀。15．2400型或9600型PCR儀。16．臺式冷凍高速離心機。17．臺式高速離心機或袖珍離心機?！静僮鞑襟E】1.PCR測序反應取的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：所加試劑測定模板管標準對照管BigDyeMix 1gl 1gl待測的質粒DNA 1皿一pGEM-3Zf(+)雙鏈DNA —1皿待測DNA的正向引物1皿—M13(-21)引物一1皿滅菌去離子水 2皿2gl總反應體積5皿，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進行擴增。98°C變性2min后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96C10s，50C5s，60C4min，25個循環(huán)，擴增結束后設置4°C保溫。2?醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物將混合物離心，將擴增產(chǎn)物轉移到EP管中。加入25皿醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4°C離心30min，小心棄上清。加70%(V/V)的乙醇50皿洗滌沉淀2次。12000r/min于4°C離心5min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10?15min。電泳前測序PCR產(chǎn)物的處理。加入12皿的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。將溶液轉移至蓋體分離的PCR管中，稍離心。在PCR儀上進行熱變性(95C2min)，冰中驟冷，待上機。上機操作按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。儀器將自動灌膠至毛細管，預電泳5min，按編程次序自動進樣，再預電泳，20min)，在下電泳2h。電泳結束后儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預電泳和電泳。每一個樣品電泳總時間為。電泳結束后儀器會自動分析或打印出彩色測序圖譜。儀器將自動進行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異堿基處，提高工作效率。測序完畢按儀器操作規(guī)程進行儀器清洗與保養(yǎng)?！居嬎恪繙y序反應精確度計算公式：100%—差異堿基數(shù)(不包括N數(shù))/650X100%差異堿基即測定的DNA序列與已知標準DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基。【注意事項與評價】ABIPRISM310基因分析儀是高檔精密儀器，需專人操作、管理和維護。本實驗測序PCR反應的總體積是5皿，而且未加礦物油覆蓋，所以PCR管蓋的密封性很重要，除加完試劑后蓋緊PCR管蓋外，最好選用PE公司的PCR管。如PCR結束后PCR液小于4?皿，則此PCR反應可能失敗，不必進行純化和上樣。3?作為測序用戶來說，只需提供純化好的DNA樣品和引物，一個測序PCR反應使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR測序所需模板的量較少，一般PCR產(chǎn)物需30?90ng，單鏈DNA需50?lOOng，雙鏈DNA需200?500ng,DNA的純度一般是A260nm/A280nm為?，最好用去離子水或三蒸水溶解DNA，不用TE緩沖液溶解。引物用去離子水或三蒸水配成皿較好。4.本實驗使用的測序試劑盒是BigDye熒光標記終止底物循環(huán)測序試劑盒，一般可測DNA長度為650bp左右