抗體制備和純化

第一節(jié)常規(guī)抗血清的制備方法一、動物的免疫二、抗血清的采集1、免疫動物的選擇2、抗原接種3、佐劑的應(yīng)用動物的免疫免疫動物的選擇種屬與品系經(jīng)濟性“R”型與“H”型經(jīng)驗性適配抗原接種劑量：注射途徑：間隔與免疫時間：接種次數(shù)：佐劑的概念與種類概念：與抗原同時或先于抗原進入機體，以提高抗原的免疫原性的物質(zhì)。種類：非免疫原性物質(zhì)免疫原性物質(zhì)佐劑的作用機理延長抗原的作用時間增強吞噬作用刺激抗原提呈促進細胞因子分泌誘導(dǎo)淋巴細胞分裂、增殖影響T細胞“極化”1、采集方法2、血清的分離與滅活抗血清的采集采集方法一次性采集多次性采集抗血清的分離與滅活血清析出的溫度血清的滅活

第二節(jié)單克隆抗體的制備方法一、單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)二、單克隆抗體的制備過程三、單克隆抗體的特性單克隆抗體與雜交瘤技術(shù)1、單克隆抗體2、雜交瘤技術(shù)表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體

由一個識別單一抗原決定簇（表位）的B細胞克隆所產(chǎn)生的同源抗體。雜交瘤技術(shù)

通過融合經(jīng)免疫的小鼠脾細胞和建系小鼠骨髓瘤細胞，以獲得同時具有抗體分泌功能和保持細胞永生性特征的雜交瘤細胞克隆。是獲取單克隆抗體的主要技術(shù)途徑。單克隆抗體制備過程1、致敏淋巴細胞的準備2、骨髓瘤細胞的準備3、細胞融合4、選擇性培養(yǎng)5、抗體分泌細胞的篩選6、克隆化過程7、單克隆抗體的制取抗原致敏淋巴細胞骨髓瘤細胞融合選擇性培養(yǎng)抗體分泌細胞篩選克隆化單抗制取單抗純化單抗鑒定致敏淋巴細胞的準備動物選擇：品系、年齡、性別、健康狀態(tài)抗原接種：方式——體內(nèi)、體外劑量——0.5-100g

次數(shù)——視抗原而定間隔——視抗原而定佐劑——視抗原而定收集時間：末次接種后72h骨髓瘤細胞的準備細胞株處于良好的生長狀態(tài)細胞株保持HGPRT缺陷狀態(tài)細胞融合方式：物理、化學(xué)、生物PEG融合要點：（見圖）致敏淋巴細胞骨髓瘤細胞離心1000rpm10min50%PEG1ml培養(yǎng)液

10ml離心1000rpm7min37。C搖動、由慢漸快1min、靜止1.5min加入HAT培養(yǎng)液懸浮細胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi)選擇性培養(yǎng)隨機融合后的細胞類型HAT選擇培養(yǎng)原理隨機融合后的細胞類型細胞組合HGPRT生長狀態(tài)淋巴細胞+骨髓瘤+長期生長淋巴細胞+淋巴細胞+短期生長骨髓瘤+骨髓瘤—不能生長未融合淋巴細胞+短期生長未融合骨髓瘤—不能生長HAT選擇培養(yǎng)原理核苷酸從頭合成途徑（denovosynthesis）核苷酸補救合成途徑（salvagesynthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）抗體分泌細胞的篩選對篩選方法的要求：多——大量樣品一次檢測快——迅速取得檢測結(jié)果準——檢測結(jié)果可靠性高靈——檢測方法靈敏度高常用篩選方法：

ELISA、RIA、CDC、IFA等克隆化過程概念：建立單一細胞克隆方法：有限稀釋法克隆建立的標準：連續(xù)兩次以上100%陽性孔飼養(yǎng)細胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾細胞有限稀釋法計數(shù)103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔單克隆抗體的制取制取方式：體外——培養(yǎng)罐法體內(nèi)——腹腔接種純化：鹽析、層析、制備型HPLC鑒定：特征鑒定——Ig類型、親和力、效價、特異性決定簇鑒定——是否針對同一決定簇多抗與單抗制劑的比較

多抗單抗單抗（血清）（腹水）（培養(yǎng)上清）特異性抗體含量（mg/ml）無關(guān)Ig含量（mg/ml）100.5-1—其他血清蛋白大量極少—均一性—++特異性多決定簇單決定簇單決定簇穩(wěn)定性較好略差略差重復(fù)性差好好單克隆抗體的特性1、理化性狀高度均一2、抗原結(jié)合性高度特異3、生物活性高度單一

第三節(jié)抗體的純化與鑒定一、抗體純化的目的與方法二、純化抗體的鑒