微生物檢驗(yàn)授課講稿1第一頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日無(wú)菌室的質(zhì)量管理菌種保存、復(fù)壯及管理藥品微生物限度檢查方法藥品微生物檢查法的驗(yàn)證2第二頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日無(wú)菌室的管理陳設(shè)盡量簡(jiǎn)單，僅放置必需用的儀器設(shè)備無(wú)菌室應(yīng)每周和每次操作前用0.1%新潔爾滅擦拭操作臺(tái)及可能污染的死角，室內(nèi)無(wú)菌空氣過(guò)濾器及紫外燈殺菌1小時(shí)。人員：肥皂洗手，0.1%新潔爾滅洗手，換無(wú)菌服、鞋，進(jìn)入。操作必須符合無(wú)菌要求，穿好無(wú)菌服后，不能反復(fù)出入無(wú)菌間，手不能來(lái)回出入操作臺(tái)。在每次操作完畢，同樣用上述消毒溶液擦拭工作臺(tái)面，除去空氣濕氣，用紫外燈殺菌半小時(shí)。非無(wú)菌室工作人員不得進(jìn)入，對(duì)外來(lái)維修人員要進(jìn)行監(jiān)督。緩沖間不得放雜物、培養(yǎng)箱等。定期對(duì)門(mén)、窗、墻面等消毒。定期檢查潔凈度情況。3第三頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日通常，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)劃分成潔凈或無(wú)菌區(qū)域和活菌操作區(qū)域，同時(shí)應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康模跁r(shí)間或空間上有效分隔不相容的試驗(yàn)活動(dòng)，將交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)降低到最低。一般情況下，藥品微生物檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有符合無(wú)菌檢查法和微生物限度檢查法要求的、用于具有開(kāi)展無(wú)菌檢查、微生物限度檢查、無(wú)菌采樣等檢測(cè)活動(dòng)的、獨(dú)立設(shè)置的潔凈室（區(qū)）或隔離系統(tǒng)，并為上述檢驗(yàn)配備相應(yīng)的細(xì)菌（真菌）等實(shí)驗(yàn)室、培養(yǎng)室、培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)用具準(zhǔn)備（包括滅菌）區(qū)、樣品接收和儲(chǔ)藏區(qū)、標(biāo)準(zhǔn)菌株儲(chǔ)藏區(qū)、污染物處理區(qū)和文檔處理區(qū)等輔助區(qū)域，同時(shí)，應(yīng)對(duì)上述區(qū)域明確標(biāo)識(shí)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)進(jìn)出潔凈區(qū)域的人和物建立控制程序和標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，應(yīng)按相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)建立潔凈室（區(qū)）和隔離系統(tǒng)的驗(yàn)證、使用和清潔維護(hù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，對(duì)可能影響檢測(cè)結(jié)果的工作（如潔凈度驗(yàn)證及監(jiān)測(cè)、消毒、清潔維護(hù)等）能夠有效地控制、監(jiān)測(cè)并記錄。4第四頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日潔凈度的要求

應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗(yàn)全過(guò)程必須無(wú)菌。工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。5第五頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日5個(gè)基本概念⑴抑菌：抑制體內(nèi)或體外細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。⑵防腐：防止或抑制體外細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的方法。細(xì)菌一般不死亡。使用同一種化學(xué)藥品在低濃度時(shí)為防腐劑，在高濃度時(shí)為消毒劑。⑶消毒：殺滅物體上病原微生物的方法。并不一定殺死含芽孢的細(xì)菌或非病原微生物。用來(lái)消毒的藥品叫消毒劑。一般消毒劑在常用濃度下只對(duì)細(xì)菌的繁殖體有效，對(duì)其芽孢則需提高消毒劑的濃度和延長(zhǎng)作用時(shí)間。⑷無(wú)菌：不存在活菌。⑸滅菌：殺滅物體上所有微生物的方法。比消毒要求高，它殺滅了包括細(xì)菌芽孢在內(nèi)的全部病原微生物和非病原微生物。6第六頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日滅菌和消毒的比較：共性：殺滅微生物以控制其污染和防止傳染。區(qū)別：1、殺滅微生物完全性的差異。滅菌要求完全殺滅微生物，滅菌后的藥品不應(yīng)含有活的微生物。而消毒不完全殺滅微生物，只能殺滅一部分微生物即病原微生物。這是相對(duì)的。因?yàn)閺?qiáng)效消毒劑在適宜條件下可能達(dá)到滅菌效果；不適宜條件下滅菌，有不完全殺滅微生物的可能。2、方法上的差異：滅菌方法具有多樣性，消毒常借化學(xué)物質(zhì)。3、效果檢查的差異：滅菌效果用無(wú)菌檢查法檢測(cè)，而消毒效果以消毒劑的效價(jià)評(píng)定。7第七頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日常用的消毒劑潔凈室（區(qū)）常用的消毒劑甲醛薰蒸（作用機(jī)制：阻抑菌細(xì)胞核蛋白質(zhì)合成。甲醛是一種常用的殺細(xì)菌和殺真菌劑。市售的福爾馬林溶液就是37—40%的甲醛水溶液。常用于保存動(dòng)物標(biāo)本，也可以作氣體熏蒸和液體消毒。甲醛有揮發(fā)性，對(duì)眼睛、皮膚有刺激性，引起皮膚硬化或皺褶，不宜做皮膚消毒用。）0.1%新潔爾滅溶液(作用機(jī)制：使蛋白質(zhì)變性，破壞細(xì)胞膜。)75%酒精溶液（常用于皮膚消毒。能迅速殺死細(xì)菌繁殖體，對(duì)一般病毒有一定的消毒作用。）5%來(lái)蘇水(甲酚皂)溶液（作用機(jī)制：損傷細(xì)胞膜）8第八頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日滅菌的方法1、熱力滅菌：主要是利用高溫的致死作用，使微生物的蛋白質(zhì)和核酸等重要生物高分子發(fā)生變性、破壞，而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。分為干熱滅菌與濕熱滅菌(1)干熱滅菌：灼燒與火焰滅菌、干烤滅菌

灼燒主要用于接種工具滅菌，如接種針、接種環(huán)、刀、剪等在火焰上燒灼即可達(dá)到徹底滅菌。

火焰滅菌是在無(wú)菌操作中，將試管口、玻璃瓶口、硅氟塑料塞等反復(fù)通過(guò)火焰數(shù)次，利用火焰對(duì)管口等進(jìn)行滅菌，防止管口污染，作為無(wú)菌操作過(guò)程中的輔助滅菌手段。

干烤滅菌是利用熱輻射及干熱空氣進(jìn)行滅菌。9第九頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日2)濕熱滅菌法：通過(guò)熱蒸汽或沸水使細(xì)菌蛋白質(zhì)變性而殺滅微生物的方法。包括：煮沸滅菌、流通蒸汽滅菌、高壓蒸汽滅菌煮沸滅菌：加熱使水至沸而殺滅細(xì)菌的方法。凡不適于高壓蒸汽滅菌的物品可常壓下在水中煮沸一段時(shí)間達(dá)到滅菌目的。流通蒸汽滅菌：常壓下，用蒸籠、蒸鍋等在100℃滅菌。僅可殺死細(xì)菌繁殖體，不能完全殺滅芽孢。高壓蒸汽滅菌：通過(guò)加壓提高蒸汽溫度，用高壓蒸汽滅菌，穿透力強(qiáng)、溫度高、滅菌效果最好。是最可靠最適用最廣泛的滅菌方法，凡耐高溫和潮濕的物品可應(yīng)用本法滅菌。注意事項(xiàng)：完全排出高壓滅菌器內(nèi)的冷空氣。（冷空氣存在時(shí)，同一表壓下所達(dá)到的溫度值偏低，不符合規(guī)定的要求，滅菌就不徹底。)10第十頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日2、氣體滅菌：利用化學(xué)消毒劑形成的氣體來(lái)殺滅微生物。臭氧殺菌消毒廣泛存在于自然界中，雷雨過(guò)后的空氣有一種清新的感覺(jué)，是因?yàn)榭罩蟹烹姰a(chǎn)生臭氧，消滅了空氣中的微生物，凈化了空氣。臭氧具有強(qiáng)烈的殺菌消毒作用。其殺菌消毒原理是：臭氧在常溫、常壓下分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，很快自行分解成氧和單個(gè)氧分子，后者具有很強(qiáng)的活性，對(duì)細(xì)菌具有很強(qiáng)的氧化作用，臭氧氧化分解了細(xì)菌內(nèi)氧化葡萄糖所必需的酶，從而破壞其細(xì)胞膜，將它殺死。多余的氧原子則會(huì)自行重新結(jié)合成為普通氧分子，不存在任何有毒殘留物，故稱為無(wú)污染消毒劑。不但對(duì)各種細(xì)菌（包括肝炎病毒、大腸桿菌、綠膿桿菌及雜菌等）有極強(qiáng)的殺滅能力，且對(duì)殺死霉菌也很有效。

11第十一頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日3、輻射滅菌（1）電離輻射:用引起電離的X射線、γ射線滅菌。電離輻射對(duì)微生物的致死作用，主要是細(xì)胞內(nèi)生物化學(xué)的變化所致。輻射的藥品、食品的安全問(wèn)題：輻射滅菌用于藥品或食品都應(yīng)經(jīng)過(guò)安全試驗(yàn)，完全有必要進(jìn)行科學(xué)全面的評(píng)價(jià)，高劑量的輻射更應(yīng)慎重。Co60輻射滅菌后，被輻射物質(zhì)的溫度升高很少，一般僅約5℃，故Co60輻射滅菌又稱“冷滅菌”。（2）電磁波輻射（包括紫外線[波長(zhǎng)190～350nm]、紅外線[波長(zhǎng)0.77～1000μm]、微波[波長(zhǎng)1～1000mm]）。12第十二頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日紫外線滅菌1、紫外線輻射的穿透力很弱，因此主要用于無(wú)菌室、某些工作區(qū)的空氣滅菌、物體表面滅菌。2、實(shí)踐工作中在無(wú)菌室無(wú)菌柜凈化工作臺(tái)工作室及車間安裝紫外燈，一般僅起殺死空氣中部分微生物的作用，而不能起到完全滅菌的作用。3、紫外線消毒方法驗(yàn)證中紫外燈需確認(rèn)的參數(shù)主要有紫外線的波長(zhǎng)、紫外線強(qiáng)度、燈管的壽命。（254nm；90uw/㎡;1000小時(shí)）4、紫外燈消毒的效果與紫外線強(qiáng)度、照射時(shí)間、溫度與濕度等因素有關(guān)，還需通過(guò)驗(yàn)證來(lái)確定。5、注意事項(xiàng)：紫外線直射對(duì)眼、皮膚有損害。紫外線照射過(guò)程中產(chǎn)生臭氧，臭氧過(guò)多對(duì)眼及鼻腔有刺激，產(chǎn)生頭暈、胸悶、血壓降低，所以無(wú)菌室及凈化工作臺(tái)紫外線照射停止后，請(qǐng)稍等片刻，讓臭氧消散，方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。13第十三頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日4、過(guò)濾滅菌：以物理的方法除去介質(zhì)中的微生物。常將空氣或液體中的微生物及雜質(zhì)用不同材料制成的薄膜濾器過(guò)濾得到無(wú)菌、無(wú)雜質(zhì)的空氣或液體。濾過(guò)病毒的濾膜孔徑為25～100nm；濾過(guò)細(xì)菌的濾膜孔徑為0.22～0.45μm。14第十四頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)室在儀器設(shè)備完成相應(yīng)的檢定、校準(zhǔn)、驗(yàn)證、確認(rèn)其性能，并形成相應(yīng)的操作、維護(hù)和保養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程后方可正式使用，使用要有記錄。為保證設(shè)備處于良好工作狀態(tài)，應(yīng)定期維護(hù)和期間核查，并保存相關(guān)記錄。微生物實(shí)驗(yàn)室所用的儀器應(yīng)根據(jù)日常使用的情況進(jìn)行定期的校準(zhǔn)，并記錄。校準(zhǔn)的周期和校驗(yàn)的內(nèi)容將根據(jù)儀器的類型和設(shè)備在實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的重要性的不同而不同。重要的儀器設(shè)備，如培養(yǎng)箱、冰箱等，應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，保證其運(yùn)行狀態(tài)正常和受控，同時(shí)應(yīng)有相應(yīng)的備用設(shè)備以保證試驗(yàn)菌株和微生物培養(yǎng)的連續(xù)性；對(duì)于培養(yǎng)箱、冰箱、高壓滅菌鍋等影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵設(shè)備應(yīng)在其運(yùn)行過(guò)程中對(duì)關(guān)鍵參數(shù)（如溫度、壓力）進(jìn)行連續(xù)觀測(cè)和記錄，有條件的情況下盡量使用自動(dòng)記錄裝置。如果發(fā)生偏差，應(yīng)評(píng)估對(duì)以前的檢測(cè)結(jié)果造成的影響并采取必要的糾正措施。對(duì)于一些容易污染微生物的儀器設(shè)備如水浴鍋、培養(yǎng)箱、冰箱和生物安全柜等應(yīng)定期進(jìn)行清潔和消毒。對(duì)試驗(yàn)需用的無(wú)菌器具應(yīng)實(shí)施正確的清洗、滅菌措施，并形成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，無(wú)菌器具應(yīng)有明確標(biāo)識(shí)并與非無(wú)菌器具加以區(qū)別。15第十五頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日菌種保存、復(fù)壯及管理

保存原則

保存方法復(fù)壯管理16第十六頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日菌種的保存原則挑選特征典型的純菌菌落確定保存的合適菌體形態(tài)，凡能產(chǎn)生孢子或芽孢的微生物都用孢子或芽孢保存選擇最適宜的保存方法進(jìn)行保存定期對(duì)保存的菌種進(jìn)行檢查17第十七頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日菌種保存的常用方法瓊脂斜面低溫保存法甘油冷凍管保藏法半固體瓊脂斜面低溫保存法液體石蠟保存法超低溫保存法（菌種）砂土18第十八頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日1.瓊脂斜面低溫保存法（1）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，待充分生長(zhǎng)后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保藏時(shí)間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔2-3個(gè)月移種一次，繼續(xù)進(jìn)行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年至一年。有的甚至更長(zhǎng)時(shí)間。（2）適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏（3）特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是——簡(jiǎn)便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對(duì)大多數(shù)微生物都適用。缺點(diǎn)是——保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。19第十九頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日4）注意事項(xiàng)：保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。保藏時(shí)，破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動(dòng)或生霉，如有異常應(yīng)及時(shí)處理。每次移植后，應(yīng)與原菌種的編號(hào)、名稱逐一核對(duì)，確證培養(yǎng)基特征和純度無(wú)誤后再繼續(xù)保藏。保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無(wú)糖，其他菌類含糖小于2%為宜，以免產(chǎn)酸過(guò)多，影響菌種存活。銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。20第二十頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日2、液體石蠟保存法：

本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長(zhǎng)菌種的保藏期。

（1）方法：將菌種接種于斜面或穿刺于0.3-0.5%瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。取化學(xué)純的液體石蠟裝在試管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對(duì)細(xì)菌保藏效果較差。（3）特點(diǎn)：本方法簡(jiǎn)便易行，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。21第二十一頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日（4）注意事項(xiàng)：①保藏時(shí)，用新鮮培養(yǎng)物接種，應(yīng)檢查純度和特征后，方可進(jìn)行保藏。②保藏過(guò)程中，需經(jīng)常觀察斜面是否干燥，如干燥,需重新移種。③使用菌種時(shí)，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上即可使用。④將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時(shí)，液體石蠟四濺，引起污染。⑤液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴(yán)格控制，如太多，會(huì)影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1㎝為宜。

⑥制備無(wú)菌液體石蠟時(shí)，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。22第二十二頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日3、半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.5%）4、40%甘油保存法：

23第二十三頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日菌種的復(fù)壯分離純化：瓊脂平板分離、單細(xì)胞（菌體或孢子）的分離通過(guò)宿主復(fù)壯淘汰退化理化因素誘變24第二十四頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日

沙門(mén)菌——SS瓊脂平板大腸埃希菌——EMB瓊脂平板25第二十五頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日銅綠假單胞菌——

溴化十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基26第二十六頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日菌種的管理專人管理，加鎖保存在冰箱內(nèi)，保存菌種的冰箱不得放置食品及易揮發(fā)性試劑及有機(jī)溶媒等。定期有專人按操作規(guī)程進(jìn)行傳代接種。并做純度、特性等實(shí)驗(yàn)室所需關(guān)鍵診斷指標(biāo)的確認(rèn)，并記錄；每支菌種都應(yīng)適當(dāng)標(biāo)注，注明其名稱、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、接種日期、所傳代數(shù)；菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。菌種定期檢查，發(fā)現(xiàn)染菌及變異現(xiàn)象應(yīng)及時(shí)報(bào)告，研究處理。實(shí)驗(yàn)菌種不得任意帶出。使用致病菌時(shí)應(yīng)及時(shí)通知保管人員，用后必須及時(shí)處理。27第二十七頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日菌種金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]大腸埃希菌(Escherichiacoli))[CMCC(B)44102]枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]乙型副傷寒沙門(mén)菌（SalmonellaparatyphiB）[CMCC(B)50094]28第二十八頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日菌液的制備（1）接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯中，30～35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，取此培養(yǎng)液1ml加0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5

～10-7，使細(xì)菌數(shù)約為10～100cfu/ml。29第二十九頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日菌液的制備（2）接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)18-24小時(shí)，取此培養(yǎng)物1ml加0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5-10-7，使細(xì)菌數(shù)約為50-100cfu/ml。30第三十頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日菌液的制備（3）

接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加3-5ml0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，取1ml加0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4-10-6，使細(xì)菌數(shù)約為50～100cfu/ml。

31第三十一頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日藥品微生物限度檢查方法微生物限度檢查法：檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。是判定藥品受到微生物污染程度的重要指標(biāo)，也是對(duì)生產(chǎn)企業(yè)的設(shè)備器具、工藝流程、生產(chǎn)環(huán)境和操作者的衛(wèi)生狀況進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)的綜合依據(jù)之一。藥品的生產(chǎn)、貯存、銷售過(guò)程中的檢驗(yàn)，原料及輔料的檢驗(yàn)，新藥標(biāo)準(zhǔn)制訂，進(jìn)口藥品標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核，考察藥品質(zhì)量及仲裁等，除另有規(guī)定外，其微生物限度檢查均以本標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。檢查項(xiàng)目：細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌的檢查。32第三十二頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)培養(yǎng)基配制的注意事項(xiàng)：采用干燥培養(yǎng)基，按說(shuō)明配制，滅菌后對(duì)培養(yǎng)基pH值進(jìn)行校驗(yàn)。配制的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀，如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過(guò)濾，滅菌后使用。培養(yǎng)基的分裝量一般不超過(guò)容器的1/3，以免滅菌時(shí)溢出。包裝時(shí)，塞子必須塞緊，以免松動(dòng)或脫落造成染菌。培養(yǎng)基配制后在2h內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖，影響滅菌效果。滅菌后的培養(yǎng)基在冷暗處保存?zhèn)溆?，放置時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，一般不超過(guò)1個(gè)月，倒好的碟子不過(guò)3～5天，以免水分散失及染菌。已熔化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，不能反復(fù)使用。不用電爐直接熔化，以免局部過(guò)熱營(yíng)養(yǎng)成份被破壞。應(yīng)用水浴或微波爐加熱。33第三十三頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日操作技術(shù)中的注意事項(xiàng)將物品一次準(zhǔn)備完全，避免來(lái)回出入操作臺(tái)、無(wú)菌室，全過(guò)程必須符合無(wú)菌技術(shù)要求。不溶于水的樣品，必須加乳化劑、助溶劑等溶解后操作。勿在乙醇燈焰正上方操作，以免燈焰將供試液中菌細(xì)胞殺滅。加完稀釋劑后，試管塞就立即塞上?？焖傥?、吹打，不能用嘴吹吸，吸管內(nèi)放棉花管尖不許接觸可能污染的任何容器或用具稀釋時(shí)每一級(jí)換管（原吸管不要吹洗），上一級(jí)吸管不能接觸下一級(jí)稀釋液34第三十四頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日取均勻供試液稀釋、注平皿（特別注意研細(xì)）上清液和沉淀物影響測(cè)定結(jié)果注平皿時(shí)，要求管內(nèi)不殘留溶液3.3制最準(zhǔn)確，即3級(jí)稀釋，3個(gè)平皿，但廠方也可根據(jù)自己品種選擇培養(yǎng)基嚴(yán)格控制在45±1℃，水浴。培養(yǎng)基搖合快速、均勻，不要濺到皿邊和皿蓋上。從稀釋到傾注培養(yǎng)基全部操作在1小時(shí)內(nèi)全部完成。35第三十五頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日結(jié)果判斷的注意事項(xiàng)不要漏計(jì)細(xì)小的（可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間）、瓊脂內(nèi)和平皿邊緣生長(zhǎng)的菌落。注意細(xì)菌、酵母菌及霉菌的區(qū)別，以及菌落與藥渣、培養(yǎng)基沉淀、藥物結(jié)晶的區(qū)別。平均菌落在15個(gè)以下時(shí)，二個(gè)平皿的菌落數(shù)不在0－4，1－7，2－9，3－10，4－12，5－14，6－15范圍內(nèi)；平均菌落在15個(gè)以上時(shí)，二個(gè)平皿菌落數(shù)超過(guò)1倍；三級(jí)菌落數(shù)不能顯示差別。不能計(jì)數(shù)需重新實(shí)驗(yàn)。36第三十六頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日異常情況處理菌落蔓延1.加TTC（1000ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂加1％的TTC1ml）2.開(kāi)蓋干燥（倒置斜放1～2h）3.換陶瓦蓋（干熱滅菌的）異常菌落數(shù)報(bào)告法

細(xì)菌平皿上長(zhǎng)霉菌、霉菌平皿上長(zhǎng)細(xì)菌，哪個(gè)多，以哪個(gè)計(jì)數(shù)，不能相加計(jì)數(shù)。37第三十七頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日藥品微生物檢查法的驗(yàn)證

38第三十八頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日

●無(wú)菌產(chǎn)品無(wú)菌檢查方法的驗(yàn)證●控制菌檢查方法的驗(yàn)證●細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證39第三十九頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日●驗(yàn)證的目的:確認(rèn)所采用的方法適合于供試品的無(wú)菌檢查或微生物限度檢查。即確認(rèn)供試品在該檢驗(yàn)量、該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不計(jì)。

●驗(yàn)證的意義：保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗(yàn)方法的完整性。40第四十頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日藥品無(wú)菌檢查方法的驗(yàn)證（1）驗(yàn)證用菌株：金黃色葡萄球菌、銅綠色假單胞菌、枯草桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。菌株選擇的原則:代表性,普遍性,易存活、低或非致病性,標(biāo)準(zhǔn)菌株(或該藥品中常見(jiàn)的污染菌)。菌種的要求：不得超過(guò)5代。采用適宜的方法保存。加菌量:＜100cfu。41第四十一頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日藥品無(wú)菌檢查方法的驗(yàn)證（2）驗(yàn)證方法：直接接種法、薄膜過(guò)濾法。結(jié)果判斷：如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，供試品照此檢查法和檢查條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查法檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，可采用增加沖洗量，增加培養(yǎng)基的用量，使用中和劑或滅活劑；更換濾膜品種等方法，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。42第四十二頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日微生物限度檢查的驗(yàn)證內(nèi)容細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證--準(zhǔn)確性(回收率)控制菌檢查法的驗(yàn)證--專屬性43第四十三頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證⑴驗(yàn)證用菌株：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草桿菌。菌株選擇的原則:代表性,普遍性,低或非致病性,標(biāo)準(zhǔn)菌株(或該藥品中常見(jiàn)的污染菌)。菌種的要求：不得超過(guò)5代。采用適宜的方法保存。加菌量:50～100cfu。44第四十四頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證-驗(yàn)證方法⑵驗(yàn)證時(shí)，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。45第四十五頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證-驗(yàn)證方法⑶試驗(yàn)組菌液組稀釋劑對(duì)照組供試品對(duì)照組46第四十六頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日試驗(yàn)組平皿法：取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液1ml和50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。薄膜過(guò)濾法：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過(guò)濾，沖洗，應(yīng)在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗(yàn)菌，過(guò)濾，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌數(shù)。47第四十七頁(yè)，共五十五頁(yè)，2022年，8月28日

稀釋劑對(duì)照組:若供試液制備需要分散、乳化，中和、離心或薄膜過(guò)濾等特殊處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，以考察供試液制備過(guò)程中微生物受影響的程度。試驗(yàn)時(shí)，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50～100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。菌液組：測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。供試品對(duì)照組：取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。48第四十八頁(yè)，共五十五頁(yè)，2