生物化學實驗第1頁第1頁第2頁第2頁四、試驗室規(guī)則1.穿工作服。2.嚴格按操作規(guī)程使用儀器設(shè)備。3.試驗完畢后，洗凈所用器材。4.每次一個試驗小組(輪流)做清潔衛(wèi)生。第3頁第3頁五、試驗匯報書寫實驗名稱1.目要求日期2.實驗原理3.主要辦法及儀器4.基本操作過程5.現(xiàn)象與繪圖6.計算或結(jié)果7.意義8.注意事項9.討論與小結(jié)10.思考題第4頁第4頁試驗一分光光度法第5頁第5頁一、實驗?zāi)浚赫莆辗止夤舛确ǜ拍睢⒒驹砗蛻?yīng)用；并通過試驗理解分光光度計操作辦法和環(huán)節(jié)以及理解分光光度計主要構(gòu)成部件與工作原理。

第6頁第6頁單色光與復(fù)色光單色光:僅含有某一波長光，由含有相同能量光子所構(gòu)成。復(fù)色光:與上相反，各種人眼可見色光都屬復(fù)色光。第7頁第7頁γ射線x射線真空紫外近紫外可見近紅外紅外遠紅外無線電波380－760nm10μm－－200－380nm第8頁第8頁二、分光光度法概念分光光度法是基于被測物質(zhì)分子對光含有選擇性吸取特性而建立起來分析辦法（也稱為吸光光度法）。第9頁第9頁在分光光度計中，將不同波長光連續(xù)照射到一定濃度樣品溶液時，便可得出與不同波長相對應(yīng)吸取強度。如以波長（λ）為橫坐標，吸取強度（A）為縱坐標，就可繪出該物質(zhì)吸取光譜曲線。利用該曲線能夠進行物質(zhì)定性、定量分析。第10頁第10頁特點—靈敏度高：測定下限可達10－5～10－6mol/L,10-4%～10-5%準確度能夠滿足微量組分測定要求：相對誤差2～5％（1～2％）操作簡便快速應(yīng)用廣泛第11頁第11頁三、分光光度法基本原理第12頁第12頁1.物質(zhì)對光選擇性吸取吸取(absorption):一個物質(zhì)展現(xiàn)何種顏色，是與入射光組成和物質(zhì)本身結(jié)構(gòu)相關(guān)。溶液展現(xiàn)不同顏色是由溶液中質(zhì)點（離子或分子）對不同波長光含有選擇性吸取而引發(fā)。第13頁第13頁

當依次將各種波長單色光通過某一有色溶液,測量每一波長下有色溶液對該波長光吸取程度(吸光度A)，然后以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得到一條曲線，稱為該溶液吸取光譜。吸取光譜第14頁第14頁可見、紫外吸取光譜示意圖第15頁第15頁物質(zhì)對不同色光能有選擇性吸取,即一定物質(zhì)主要吸取一定波長光(互補吸取)，是因為物質(zhì)本身分子、原子都處于一定能級運動狀態(tài)，當物質(zhì)吸取了光輻射能以后，會產(chǎn)生能級躍遷，產(chǎn)生吸取光譜。吸取光譜產(chǎn)生第16頁第16頁2.光吸取基本定律

依據(jù)吸取光譜特性和形狀可作該物質(zhì)判別、純度檢查和初步結(jié)構(gòu)分析等。但是可見／紫外吸取光譜主要應(yīng)用在定量分析方面，其定量基礎(chǔ)即為Lamber-Beer定律，是闡明吸光物質(zhì)對單色光吸取強弱與該物質(zhì)濃度與厚度間關(guān)系定律。第17頁第17頁透光度T(%)與吸光度A第18頁第18頁

透光度T(%)當一束平行單色光通過一濃度為C，液層厚度為L溶液時，該溶液將對此入射光進行吸取，使透過光強削弱。透光度則為入射前后光強比值。CL入射光強透射光強I0ItT(%)＝ItI0第19頁第19頁透光度與吸光度互相關(guān)系溶液透光度與吸光度呈負相關(guān)。A＝lg—I0It＝lg—＝－lgT1T吸光度A吸光度A是透光度負對數(shù)第20頁第20頁

1.Lamber定律—吸光度與液層厚度關(guān)系

1760年，Lamber指出，當單色光通過濃度一定、均勻吸取溶液時，該溶液對光吸取程度與液層厚度L成正比。A＝lg—I0It＝K1LLamber-Beer定律第21頁第21頁吸光度與光程（厚度：L）關(guān)系

A=KLc

檢測器L樣品光源0.22吸光度光源檢測器0.00吸光度光源檢測器0.44吸光度L樣品L樣品第22頁第22頁2.Beer定律—吸光度與溶液中吸光物質(zhì)濃度關(guān)系關(guān)系

1852年，Beer指出，當單色光通過液層厚度一定、均勻吸取溶液時，該溶液對光吸取程度與溶液中吸光物質(zhì)濃度C成正比。A＝lg—I0It＝K2C第23頁第23頁吸光度與濃度關(guān)系

A=KLc

吸光度0.00光源檢測器

吸光度0.22光源檢測器c1

吸光度0.44光源檢測器c2第24頁第24頁3.Lamber-Beer定律

將前面兩條定律結(jié)合起來，就得到下列結(jié)果：

A＝KCL

K:吸光系數(shù)，為單位濃度、單位厚度時吸光度。C:吸光物質(zhì)濃度。單位mol/LL:光通過液層厚度。單位cm第25頁第25頁A=klcA—吸光度(absorbance)L—介質(zhì)厚度(length/cm)c—濃度(concentration)K—吸光系數(shù)(absorptivity)A＝lg—I0ItItI0lc第26頁第26頁四、

分光光度計基本結(jié)構(gòu)第27頁第27頁分光光度計基本結(jié)構(gòu)

光源單色器吸取池檢測系統(tǒng)穩(wěn)壓電源第28頁第28頁722型分光光度計結(jié)構(gòu)方框圖光源吸取池檢測系統(tǒng)分光系統(tǒng)顯示系統(tǒng)第29頁第29頁

在分光光度計上外來光源（混合光）通過棱鏡或光柵得到一束近似單色光.即將混合光中某一波長單色光分出，故稱為“分光”。長處：波長可調(diào),故選擇性好,準確度高.第30頁第30頁

光源必須含有穩(wěn)定足夠強度連續(xù)光譜?？梢姽夥止夤舛扔嫻庠赐ǔ榘鬃奇u燈，其光譜范圍為320nm---2500nm。紫外分光光度計光源是低壓氫弧燈，其光譜范圍為150nm---400nm。1.光源第31頁第31頁

單色器是將復(fù)雜白光分散成單色光裝置，其過程為光色散。色散后單色光經(jīng)反射、聚光，通過狹縫到達溶液。慣用單色器是棱鏡或光柵。2.單色器第32頁第32頁

也叫比色皿,比色杯，用來盛被測試溶液?？梢姽鈪^(qū)使用玻璃制比色皿，紫外光區(qū)使用石英制比色皿。由于玻璃會吸取紫外線。吸取池種類諸多，其光徑可在0.1~10cm之間，其中以1cm光徑吸取池最為慣用。3.吸取池第33頁第33頁

即光電轉(zhuǎn)換元件，為光電管或光電倍增管，可將透過比色皿光信號變成可測量電信號。檢測器第34頁第34頁5.顯示儀表或統(tǒng)計儀可直接讀到結(jié)果，如檢流計，微安表。第35頁第35頁五、定量分析辦法㈠原則曲線法0濃度C吸光度A第36頁第36頁幾點注意：理想標準曲線應(yīng)為：用不同濃度標準溶液所測得吸光度對濃度作圖時，是一條斜率靠近于1經(jīng)過原點直線；標準溶液濃度范圍應(yīng)在被測物質(zhì)濃度二分之一到二倍之間；吸光度在0.05---1.0之間為宜。第37頁第37頁㈡對比法將原則與樣品分別在相同條件下顯色，測定其吸光度。因是相同物質(zhì)在相同條件下測定，故可按下式計算出樣品濃度：A標A樣KC樣LKC標L=則：C樣=A標A樣C標第38頁第38頁六．顯色反應(yīng)條件選擇

對各種物質(zhì)進行測定，常利用顯色反應(yīng)將被測組分轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢úㄩL范圍有吸取物質(zhì)。第39頁第39頁這些顯色反應(yīng)，必須滿足下列條件：1．反應(yīng)生成物必須在紫外-可見光區(qū)有較強吸光能力，即摩爾吸光系數(shù)較大；2．反應(yīng)有較高選擇性，即被測組分生成化合物吸取曲線應(yīng)與共存物質(zhì)吸取光譜有明顯差別；第40頁第40頁3．反應(yīng)生成產(chǎn)物有足夠穩(wěn)定性，以確保測量過程中溶液