探究不同培養(yǎng)基中酵母菌種群數(shù)量的動態(tài)變化【摘要】釀酒酵母在生物學研究上有著重要的地位，本課題將分析其他條件不變時，培養(yǎng)液中糖的種類、濃度對釀酒酵母生長的影響，并探究其種群在穩(wěn)定環(huán)境中生長繁殖的規(guī)律，以及在其他條件不變時，培養(yǎng)液中糖的種類、濃度以及固體培養(yǎng)基中瓊脂濃度對其的影響，使對釀酒酵母的培養(yǎng)能夠更加簡便易行。經(jīng)過實驗，在針對不同糖的種類的培養(yǎng)基培養(yǎng)中，葡萄糖溶液最適宜釀酒酵母生長；在針對不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)中，葡萄糖濃度10%左右的培養(yǎng)液培養(yǎng)釀酒酵母的生長最快；在針對不同瓊脂濃度的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)中，2%的培養(yǎng)基應該比較適合酵母菌生長?！娟P鍵詞】釀酒酵母;種群;微生物培養(yǎng)1.酵母菌相關指標1.1釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）釀酒酵母是一種單細胞真菌，屬于子囊菌門半子囊菌綱酵母目酵母科酵母屬，是與人類關系最廣泛的一種酵母，在傳統(tǒng)上與發(fā)酵食品的制作密切相關，在現(xiàn)代分子生物學和細胞生物學中又常被用作真核模式生物[1]。由于釀酒酵母在生物研究上有著至關重要的地位，對影響其生長的環(huán)境因素的研究意義重大。1.2目前已有的研究已經(jīng)揭示了釀酒酵母的結(jié)構(gòu)和許多性質(zhì)，并已將研究得到的規(guī)律運用到了實踐之中，可謂成就不菲；其中，溫度是影響釀酒酵母正常生長的主要原因，而酸堿值、氧的濃度，糖源氮源和滲透壓，也會對對酵母生長產(chǎn)生影響。1.2.1溫度釀酒酵母是一種嗜溫性微生物，它生存的最低溫度是1-3℃[2]，最高溫度是54℃(幾乎致死)；當溫度達到20℃時，酵母菌的繁殖速度加快，在30℃時達到最大值；而當溫度繼續(xù)升高達到35℃時，其繁殖速度迅速下降，酵母菌呈疲憊狀態(tài)；保持1～1.5小時40～45℃，或保持10～15分鐘60～65℃的溫度，則能夠殺死酵母菌[3]。1.2.2酸堿性酸性條件比堿性條件更適合釀酒酵母生長，pH4.5為最適宜；但若酸性過強，酵母菌則會生成揮發(fā)性酸，或停止活動；不過雖然高酸度環(huán)境雖對酵母菌生長活動并不十分有利，但可以抑制其他微生物的繁殖。1.2.3氧氣釀酒酵母繁殖需要氧氣，氧越多，酵母發(fā)酵越迅速；在完全的無氧條件下，酵母菌在幾代后就會停止繁殖；若在此時給予其少量空氣，它們便能再次出芽繁殖，但若缺氧時間過長，多數(shù)酵母細胞就會死亡。 1.2.4營養(yǎng)物質(zhì)隨著發(fā)酵的進行，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗量會影響微生物的生長，而釀酒酵母對營養(yǎng)缺乏耐受性較好；因此，一般情況下營養(yǎng)脅迫主要發(fā)生在發(fā)酵后期[4]。1.3常用培養(yǎng)基根據(jù)已有研究得到的各項最適條件，一般配置YPD培養(yǎng)基，即酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基，來培養(yǎng)酵母菌。此外，國家標準檢驗方法使用馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)釀酒酵母，并且需培養(yǎng)5d才能進行酵母菌計數(shù)[5]。1.4近期研究現(xiàn)狀在已經(jīng)得出的結(jié)果中，盡管已經(jīng)分析了糖源和營養(yǎng)物質(zhì)對酵母生長的影響，但未能綜合兩方面因素，探究出最適宜釀酒酵母生長的培養(yǎng)液種類及其濃度；雖然在討論營養(yǎng)脅迫問題時提及了“發(fā)酵后期”的概念，但在筆者現(xiàn)今所閱文獻中，沒有實驗結(jié)論明確說明整個發(fā)酵過程的具體特征。針對這兩點現(xiàn)有研究成果中存在的疏漏之處，我們將在已有研究得到的適宜溫度和酸堿條件下，于本研究中分析其他條件不變時，培養(yǎng)液中糖的種類、濃度以及固體培養(yǎng)基中瓊脂濃度對釀酒酵母生長的影響，并探究其種群在穩(wěn)定環(huán)境中增長的規(guī)律，使對釀酒酵母的培養(yǎng)實驗，尤其是廣大基礎教育中所進行的定性實驗，能夠更加簡便易行[5]。2.研究材料與方法2.1酵母菌的培養(yǎng)液種類對酵母生長的影響探究酵母菌種群數(shù)量在培養(yǎng)液中的動態(tài)變化，并探索常見糖中哪種最適合用作酵母菌的培養(yǎng)液。2.1.1實驗器材顯微鏡，血細胞計數(shù)板，載玻片，試管架，電子天平，超凈臺，滅菌鍋，恒溫搖床，移液器，200μL移液器吸頭，50mLEP管；質(zhì)量分數(shù)為2%、10%、15%、20%的葡萄糖溶液。2.1.2實驗操作①配置培養(yǎng)液。取6支50mLEP管分別配制成10mL10%的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖、纖維素溶液，用記號筆標注溶液種類、日期。②滅菌。配好的糖溶液115℃高壓蒸汽滅菌30min；200μL移液器吸頭裝入槍頭盒，121℃高壓蒸汽滅菌20min。③接種與培養(yǎng)。將S.cerevisiae原始菌液顛倒混勻，用微量移液器取80μL培養(yǎng)液，分別接種于不同EP管，振蕩搖勻。吸取酵母菌懸液觀察計數(shù)(方法如第4步所述)。稍擰松接種后的管蓋以便氧氣能夠進入，然后將EP管置于恒溫搖床中，28℃、206r/min培養(yǎng)。④取樣與顯微鏡計數(shù)。將EP管中的培養(yǎng)液振蕩搖勻，用移液器吸取，每隔24h取樣1次，共7次。將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片。將用亞甲基藍染色的酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自行進入計數(shù)室。靜置5min。將血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用10倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行觀察，記錄未被染色的酵母菌數(shù)。如菌液密度過大(每個小方格超過10個菌體)則需要將樣品稀釋后計數(shù)，如果密度過小(每個中方格少于10個菌體)，則計整個大方格中所有的菌體數(shù)。每個計數(shù)室選4個角和中央的中方格中的菌體進行計數(shù)。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的1／2時，即作2個菌體計數(shù)。位于5x5大格格線上的菌體只計數(shù)上、左邊線上的[6]。⑤菌液密度計算。按公式：菌液密度(個／mL)=A×5×10^4×B（A為5個小方格中酵母菌總數(shù)．B為稀釋倍數(shù)）計算菌液密度，對2個計數(shù)室得到的菌液密度取平均值，計為該樣品菌液密度，對同一處理的2個重復樣品取平均值計為該處理的菌液密度。⑥數(shù)據(jù)處理。將第4、5步所得的數(shù)據(jù)匯總到實驗數(shù)據(jù)記錄表中，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制擬合函數(shù)圖并分析。2.2酵母菌的培養(yǎng)液濃度對酵母生長的影響2.2.1實驗器材顯微鏡，血細胞計數(shù)板，載玻片，試管架，電子天平，超凈臺，滅菌鍋，恒溫搖床，移液器，200μL移液器吸頭，50mLEP管；質(zhì)量分數(shù)為2%、10%、15%、20%的葡萄糖溶液。2.2.2實驗操作①滅菌。配好的質(zhì)量分數(shù)為20%的葡萄糖溶液溶液115℃高壓蒸汽滅菌30min，200μL移液器吸頭裝入槍頭盒，121℃高壓蒸汽滅菌20min。②培養(yǎng)液分裝。在超凈工作臺中取4支50mLEP管分別加入20%葡萄糖儲液和無菌蒸餾水，配制成10mL2%、10%、15%、20%的葡萄糖溶液，用記號筆標注溶液種類、日期。③~⑤接種與培養(yǎng)、取樣與顯微鏡計數(shù)、數(shù)據(jù)處理，方法同實驗一。 2.3培養(yǎng)基瓊脂濃度對酵母生長的影響2.3.1實驗器材一次性無菌培養(yǎng)皿（9個），涂布棒，電子天平，超凈臺，滅菌鍋，移液器，200μL移液器吸頭。2.3.2實驗操作①配置固體培養(yǎng)基。使用1%YeastExtract，2%Peptone,2%Glucose,配置YPD培養(yǎng)基。然后分為三組，每組三個培養(yǎng)皿，分別配置瓊脂濃度為1%，2%，10%的3組、共9個培養(yǎng)基。②滅菌。配好的YPD培養(yǎng)基，200μL移液器吸頭115℃高壓蒸汽滅菌40min。③接種與培養(yǎng)。將三組培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每組三個培養(yǎng)皿，一共九個。將Saccharomycescerevisiae原始菌液顛倒混勻，用微量移液器取50μL培養(yǎng)液，使用一次性涂布棒接種于培養(yǎng)基，液體干燥后合上培養(yǎng)皿蓋。將培養(yǎng)皿倒置，并在表面標注濃度、日期，25℃培養(yǎng)。④觀察酵母菌生長狀況。記錄并觀察生長狀況。比較不同濃度培養(yǎng)皿之間的相似與區(qū)別。3.結(jié)果與討論3.1不同種類糖溶液中釀酒酵母生長結(jié)果將2.1.1中操作④、⑤取得的數(shù)據(jù)匯總得到表1，根據(jù)表1繪制不同糖溶液對酵母菌種群數(shù)量增長的影響圖(圖1)。表1不同種類糖溶液中酵母菌的種群量隨時間變化情況（單位:10^7個/mL）溶液（濃度:10%）葡萄糖果糖麥芽糖蔗糖半乳糖纖維素0h0.060.070.060.070.060.0772h1.050.280.850.891.030.55114h1.310.930.930.850.680.48138h1.150.860.900.960.700.33162h1.090.600.640.740.700.28圖1不同種類糖溶液中酵母菌的種群量隨時間變化情況從圖1可以看出，在10%的葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖、纖維素溶液中，酵母菌種群數(shù)量在162h內(nèi)呈先增后減的趨勢。其中，在葡萄糖溶液里，酵母菌種群數(shù)量增加速率和數(shù)量峰值都遠遠高于其他溶液，可見這六種糖溶液中葡萄糖溶液最適于酵母菌生長。在其他的五種糖溶液中，酵母菌種群數(shù)量增長速率和最大數(shù)量較為接近，且與葡萄糖培養(yǎng)液相比均偏低。3.2.不同濃度糖溶液中釀酒酵母生長結(jié)果 由2.1.實驗1可知酵母菌種群數(shù)量在培養(yǎng)過程中先增后減，且在常見糖類中，葡萄糖的溶液最適于酵母菌生長，下面進一步分析不同濃度葡萄糖溶液在實驗過程中引起的差異，具體分析其中酵母菌種群數(shù)量的動態(tài)變化。將2.2.1中操作④、⑤取得的數(shù)據(jù)匯總得到表2-1，根據(jù)表2-1繪制不同培養(yǎng)基對酵母菌種群數(shù)量增長的影響圖(圖2-1)。表2不同濃度的葡萄糖溶液中酵母菌的種群量隨時間變化情況（單位:10^7個/mL）葡萄糖溶液0%2%10%15%20%0h0.070.070.060.060.0772h0.010.591.051.020.92114h0.000.831.311.050.80138h0.001.151.150.910.69162h0.001.171.090.790.50圖2不同濃度的葡萄糖溶液中酵母菌的種群量隨時間變化情況從圖2可以看出，在4％、10%、15%、20％葡萄糖溶液中，酵母菌種群數(shù)量在162h內(nèi)都出現(xiàn)先增大后減小，種群增長速率先增后減，且在數(shù)量最大值的約一半處增長最快。此外，在這四種濃度的當葡萄糖溶液中，酵母菌種群數(shù)量在濃度為10％的溶液中增加最快，且在2％葡萄糖溶液中，酵母菌種群數(shù)量達到峰值后便基本不再變化。由于在這組實驗中酵母菌種群數(shù)量增長的限制因素主要有營養(yǎng)條件的限制和培養(yǎng)過程中代謝產(chǎn)物（乙醇等[7]）的抑制作用，由上述結(jié)果可以推知，在酵母菌種群數(shù)量增加過程中，葡萄糖溶液濃度在一定范圍內(nèi)（實驗中為2%至10%）越高，種群數(shù)增加速率越快，峰值越大，說明在這一階段，酵母菌種群增長的限制因素為營養(yǎng)條件，即此處的葡萄糖濃度。實驗結(jié)果顯示，4種濃度的葡萄糖溶液中種群數(shù)量最大值接近，說明葡萄糖溶液濃度對酵母菌種群數(shù)量最大值影響有限；但在濃度高于10%后，種群數(shù)量最大值隨溶液濃度增高呈降低趨勢，可能因為酵母生長過程中乙醇的產(chǎn)量和產(chǎn)生速率隨葡萄糖濃度增高而遞增，而乙醇對酵母菌有抑制作用，所以造成了酵母菌種群數(shù)量峰值的下降。3.3.不同瓊脂濃度培養(yǎng)基中釀酒酵母菌落生長情況實驗結(jié)果如圖所示。圖3-1瓊脂濃度為1%的培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果圖3-2瓊脂濃度為2%的培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果圖3-3瓊脂濃度為10%的培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果圖3-4瓊脂濃度為10%的培養(yǎng)基中出現(xiàn)“小芽”(圈中標示)在瓊脂濃度為1%的培養(yǎng)基中，菌落較大，大多菌落相連，比較濕潤（圖3-1），而瓊脂濃度為10%的培養(yǎng)基中菌落較小，比較干燥（圖3-3）。瓊脂濃度為2%的培養(yǎng)基內(nèi)菌落生長狀況介乎瓊脂濃度1%與10%的培養(yǎng)基之間。在10%瓊脂濃度固態(tài)培養(yǎng)基中，出現(xiàn)了菌落向上生長的現(xiàn)象，形似“小芽”（圖3-4）。“小芽”即菌落向上生長而成，高度大約五毫米，直徑半毫米。由于10%的瓊脂濃度固態(tài)培養(yǎng)基中氧氣較少，酵母菌因為進行有氧呼吸，在生長形成菌落過程中，需要一定量的氧氣。因為培養(yǎng)皿倒置放置，所以酵母菌落向下生長，即由固體培養(yǎng)基向空氣方向生長。生長形成“小芽”，即可增加與空氣接觸表面積，獲取更多氧氣。4.總結(jié)與展望4.1主要結(jié)論4.1.1不同種類糖溶液中酵母菌的種群量隨時間變化情況在常見糖的溶液中，葡萄糖溶液最適宜釀酒酵母生長；在含有不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)液中，葡萄糖濃度10%左右的培養(yǎng)液培養(yǎng)釀酒酵母的生長最快。4.1.2不同濃度的葡萄糖溶液中酵母菌的種群量隨時間變化情況在環(huán)境條件適宜的培養(yǎng)液中，釀酒酵母酵母種群數(shù)量先增后減，在培養(yǎng)初期加速增長，于種群數(shù)最大值的一半時增長最快，此后開始減速增長，直至于約四日后到達峰值，此后數(shù)量下降。釀酒酵母種群數(shù)量增長速度主要受營養(yǎng)條件（即此實驗中的葡萄糖濃度）限制，且在葡萄糖濃度高于10%后，種群數(shù)量最大值隨溶液濃度增高而降低。4.1.3不同瓊脂濃度培養(yǎng)基中釀酒酵母菌落生長情況基于本研究，在不同瓊脂濃度的固體培養(yǎng)基中，2%的培養(yǎng)基應該比較適合酵母菌生長。而相較標準瓊脂濃度，低瓊脂濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母菌落較大且比較濕潤；高瓊脂濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母菌落較小且干燥，而且由于其向氧氣生長的的特性，會導致部分菌落向培養(yǎng)基平面的第三維生長。4.1.4總結(jié)上述結(jié)論滿足了本次實驗目的，揭示了培養(yǎng)液中糖的種類、濃度對釀酒酵母的影響，及其種群數(shù)量在培養(yǎng)過程中的動態(tài)變化。實驗結(jié)果顯示，對于利用釀酒酵母進行的非精確定量的試驗，10%的葡萄糖溶液成本遠低于專業(yè)的YPD培養(yǎng)基，而培養(yǎng)結(jié)果現(xiàn)象明顯，尤其適于廣大中小學等基礎教育單位大規(guī)模進行的探究性實驗使用。同時，對于欲圖觀察環(huán)境因素對種群數(shù)變化的實驗，培養(yǎng)酵母菌的時間不宜超過三至四天；而對于需長期培養(yǎng)酵母的實驗，培養(yǎng)過程中應注意培養(yǎng)環(huán)境的維護，避免酵母菌死于環(huán)境影響。此研究為釀酒酵母的培養(yǎng)提供了一定的理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)，成果同時具有研究價值與實用價值。4.2不足及展望由于本實驗局限性，基于課程時間安排及實驗室使用規(guī)定，本實驗在培養(yǎng)的前70小時內(nèi)及第168小時后無法測量數(shù)據(jù)，導致實驗數(shù)據(jù)偏少，未能得到更為完整、精確的種群增長曲線。若能獲得此空白期內(nèi)的種群數(shù)量數(shù)據(jù)，得到的結(jié)論將能更具說服性。在培養(yǎng)不同瓊脂濃度固體培養(yǎng)基時，由于各組培養(yǎng)基均為倒置培養(yǎng)，所以有部分導致菌落向培養(yǎng)基平面的第三維生長的原因可能為重力的作用。經(jīng)過分析與討論，一致認為重力應該不是主要因素，且與實驗目的無關，所以并沒有再添加實驗來驗證這部分原因的比重。根據(jù)結(jié)論3.2，釀酒酵母產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物等變量對其種群的增長可能都有所影響，但本次并未對其具體探究。在后續(xù)實驗里，可對此進行進一步研究，以獲得更便利有效的酵母培養(yǎng)方式。5.收獲與體會 本次研究性學習中，我們首次經(jīng)歷了從選題到結(jié)題的全過程，在研究得到了理想成果的同時，我們也從中受益匪淺。我們對該生物學領域有了較為廣泛和深入的認識，學