對16只小熊貓進行布魯菌病血清學(xué)監(jiān)測,畜牧獸醫(yī)論文布魯菌病(brucellosis)是一種全球性分布、危害嚴(yán)重的人獸共患傳染病，能損害多種家畜、野生動物和人類等。B．Melitensis、B．Abortus、B．suis和Brucellacanis這4種布魯菌對人致病。布魯菌病在我們國家近30個省、自治區(qū)和直轄市均有分布，且近年來疫情呈明顯上升趨勢。我們國家自2000年以來，全國獸醫(yī)部門檢出的布魯菌病陽性家畜數(shù)量呈逐年上升趨勢。2018年，據(jù)阿巴嘎旗等10個國家級畜間布魯菌病疫情監(jiān)測縣數(shù)據(jù)統(tǒng)計，血清學(xué)檢查羊41736只，陽性626只，平均陽性率1．49%(陽性率1．00%～7．01%);血清學(xué)檢查牛62843頭，陽性852頭，平均陽性率1．36%(陽性率0～7．17%)。這些數(shù)據(jù)表示清楚，我們國家布魯菌病對人和動物造成的危害已經(jīng)到達非常嚴(yán)重的程度了。除羊、牛、豬對布魯菌敏感外，馬、駱駝、鹿、犬、貓、鴨、野鳥、水貂、蜱等可以感染或帶菌。野生動物如羚羊、野牛、野鹿、牦牛、野豬等對布魯菌都易感。熊、狼、狐貍、貉、野兔、小家鼠、姬鼠、蟬、海豹、海豚、水貂等亦可感染。這些動物長期帶菌傳播，成為地區(qū)間生物互相傳染的因素。四川省是小熊貓的集中分布區(qū)，由于受犬瘟熱、心絲蟲病及人類活動等因素影響，種群數(shù)量銳減。成都大熊貓繁育研究基地是全國最大的小熊貓圈養(yǎng)基地，也是全球最大的大熊貓繁育基地。當(dāng)前，缺乏對小熊貓等野生動物布魯菌病的監(jiān)測，增加了野生動物疾病向人類傳播的風(fēng)險。為此，筆者對成都大熊貓繁育研究基地內(nèi)進入繁衍期的16只小熊貓進行布魯菌病血清學(xué)監(jiān)測，彌補小熊貓布魯菌病血清學(xué)的監(jiān)測數(shù)據(jù)，杜絕小熊貓成為布魯菌病傳播的源頭。1、材料1．1樣品16只產(chǎn)房小熊貓(編號為49，56，57，59，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72)的血液樣品，于2020年3月16日和22日采自成都大熊貓繁育研究基地四川省林業(yè)廳小熊貓保衛(wèi)研究中心的小熊貓飼養(yǎng)館。1．2主要試劑布魯菌病虎紅凝集抗原及試管凝集抗原、布魯菌陰性血清、布魯菌陽性血清，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;0．5%石炭酸生理鹽水，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物疫病與人類健康四川省重點實驗室配制。2、方式方法2．1布魯菌病血清學(xué)檢測先采用布魯菌虎紅平板凝集試驗(RBPT)進行初篩，對陽性或疑似陽性樣品運用試管凝集試驗(SAT)進一步確診。RBPT試驗:于干凈玻板上滴加30L抗原，隨后參加30L受檢血清，攪拌混勻;同時設(shè)陽性和陰性血清對照。SAT試驗:參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB186462002進行。RBPT試驗的判定標(biāo)準(zhǔn):在陽性和陰性血清對照成立的前提下，受檢血清在4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象者判為陽性;無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性。此方式方法得到的結(jié)果為初篩結(jié)果。SAT試驗的判定標(biāo)準(zhǔn):在陽性和陰性血清對照成立的前提下，以出現(xiàn)50%以上凝集現(xiàn)象的最高稀釋度作為血清抗體效價。血清效價在1∶80以上判為陽性;1∶20和1∶40判為疑似反響;無凝集現(xiàn)象，液體均勻混濁者判為陰性。2．2血液細菌DNA提取及PCR鑒定無菌抽取RBPT試驗判定為布魯菌抗體陽性的小熊貓靜脈血，采用Qiagen公司的QIAampUCPPathogenMiniKit試劑盒提取血液細菌總DNA，然后擴增布魯菌屬特異性基因BCSP31。參照以下為參考文獻設(shè)計擴增布魯菌屬特異性的BCSP31引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列:F－BCSP315－TGGCTCG-GTTGCCAATATCAA－3，R－BCSP315－CGCGCTT-GCCTTTCAGGTCTG－3，擴增片段大小為223bp。PCR反響體系:10Buffer5L，2．5mmol/LdNTPs8L，上、下游引物(25mol/L)各2L，Taq酶2U，模板DNA1L。PCR反響程序:95℃5min;94℃1min，60℃1．5min，72℃1．5min，共28個循環(huán);最后72℃再延伸10min。擴增產(chǎn)物用1．5%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。3、結(jié)果與分析3．1小熊貓布魯菌病血清學(xué)檢測(結(jié)果見209頁彩圖1、圖2)由圖1可知，56號(左1)及72號(右7)樣品出現(xiàn)顆粒狀沉淀，講明這2個樣品呈RBPT陽性反響。對RBPT陽性的56號及72號樣品采用SAT試驗進一步驗證，結(jié)果液體均勻混濁，均無凝集現(xiàn)象，講明SAT試驗結(jié)果為陰性。3．2血液細菌DNA的PCR鑒定由于血清學(xué)存在一定比例的假陽性或陰性結(jié)果，試驗又對RBPT陽性樣品(56號和72號)的血液細菌總DNA進行PCR，擴增布魯菌屬特異性基因BC-SP31，結(jié)果見圖3。由圖3可知，2個樣品都未擴增出特異性條帶，講明擴增樣品內(nèi)不存在布魯菌DNA。綜合RBPT、SAT及BCSP31－PCR結(jié)果，排除了2只小熊貓感染布魯菌病的可能性。4、討論關(guān)于動物布魯菌病的處置，國家規(guī)定對牛、豬、羊及其他臨床檢查疑似布魯菌病的動物進行血清學(xué)或病原學(xué)檢測。檢疫呈陽性的動物根據(jù)GB165482006(病害動物和病害動物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程〕的規(guī)定進行銷毀處理，將布魯菌病患畜消滅在產(chǎn)地，嚴(yán)防疫畜及其產(chǎn)品進入流通環(huán)節(jié)。但這些措施在珍惜野生動物、瀕危動物甚至是國家保衛(wèi)動物中執(zhí)行卻面臨挑戰(zhàn)。到當(dāng)前為止，把握的關(guān)于野生動物布魯菌病的流行資料非常有限。固然布魯菌主要感染家畜和人類，但無論在有效施行布魯菌病控制的國家，還是已公布消滅布魯菌病的國家，野生動物布魯菌病的存在仍然對畜牧業(yè)和人類是一種潛在危害。鑒于野生動物疫病尤其是人獸共患傳染病與人類健康密切相關(guān)，發(fā)達國家已建立了較為完善的野生動物疫病監(jiān)測預(yù)警體系、管理體系和制度。但在我們國家這項工作尚處于起步階段，現(xiàn)行的(中國動物防疫法〕、(中國傳染病防治法〕、(中國野生動物保衛(wèi)法〕等法規(guī)對野生動物疫病監(jiān)測與預(yù)警還屬空白或較少，使國家在野生動物疫病種類、分布范圍、擴散途徑和發(fā)生動態(tài)方面缺乏最基本的資料，給野生動物保衛(wèi)和人類健康帶來極大隱患。因而，鑒于布魯菌病的流行特征及其對畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康的宏大危害，對野生動物布魯菌病的監(jiān)測應(yīng)該納入動物疫病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，研究制訂野生動物病原學(xué)本底調(diào)查工作規(guī)劃，確定野生動物布魯菌病監(jiān)測與防控的重點對象和區(qū)域范圍，有選擇性地進行采樣和初步檢測分析，進行病原學(xué)、血清學(xué)監(jiān)測，并在這里基礎(chǔ)上建立樣本檢測數(shù)據(jù)庫，對野生動物疫情發(fā)生和發(fā)展趨勢進行科學(xué)分析和預(yù)警，爭取做到防患于未然。國外研究者對采用口服疫苗控制野生動物布魯菌病進行了研究，結(jié)果表示清楚，野牛、糜鹿口服布魯菌弱毒株RB51，可起到一定免疫效果，這為開發(fā)野生動物口服布魯菌疫苗提供了一定基礎(chǔ)。我們國家自行研制的S2和M5疫苗可口服免疫家畜，但能否免疫野生動物值得商榷。除此之外，當(dāng)前很多圈養(yǎng)及野生動物的布魯菌病診斷都是發(fā)病后才開場進行檢疫，這時往往已造成很大的經(jīng)濟損失。而對于動物園或者諸如成都大熊貓繁育研究基地這樣的教育基地，每年都接待數(shù)以萬計的旅游者。假如動物園里的動物存在人獸共患病，勢必會嚴(yán)重威脅旅游業(yè)的發(fā)展。因而，了解人類活動頻繁地區(qū)的動物人獸共患病狀況，將有助于對這類疾病的防控。由于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物疫病與人類健康四川省重點實驗室不具備分離布魯菌病原菌的條件，在本研究中僅采用血清學(xué)及分子生物學(xué)方式方法對2例RB-PT為陽性的疑似布魯菌病進行了鑒別，而未進行布魯菌病原菌培養(yǎng)。BCSP31是布魯菌屬特異性基因，6個種的布魯菌DNA都有清楚明晰的擴增條帶，而對與布魯菌有共同抗原、并具有血清穿插凝集的耶爾森菌、大腸埃希菌和沙門桿菌的DNA擴增反響都呈陰性。因而，很多研究對布魯菌的鑒定都建立在以BCSP31為靶基因基礎(chǔ)上。本研究對RBPT陽性樣品進一步采用SAT試驗及血液細菌的PCR鑒定排除樣品布魯菌病感染，避免對病例的誤診。當(dāng)前，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物疫病與人類健康四川省重點實驗室正在對國內(nèi)一些動物園的野生動物進行布魯菌病血清學(xué)排查，進一步摸清西南地區(qū)野生動物布魯菌病血清學(xué)感染資料，為珍惜野生動物、瀕危動物甚至是國家保衛(wèi)動物能否存在布魯菌病感染，以及能否需要進行免疫提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。以下為參考文獻:［1］鐘志軍，于爽，徐杰，等．布魯菌進化和分類學(xué)研究進展［J］．中國獸醫(yī)學(xué)報，2018，31