關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)全面知識普及第1頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的理論背景設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制無菌技術(shù)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)與生長曲線凍存、復(fù)蘇與運(yùn)送常見問題及對策第2頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞培養(yǎng)的概念20世紀(jì)初才創(chuàng)立的一種研究動物細(xì)胞行為的方法。細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細(xì)胞模擬體內(nèi)出現(xiàn)環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下，使其生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。第3頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用1.藥物研究與開發(fā)(1)新藥篩選(2)疫苗研究與開發(fā)(3)基因工程藥物研究與開發(fā)(4)細(xì)胞工程藥物研究與開發(fā)2.基礎(chǔ)研究(1)藥物作用機(jī)理(2)基因功能(3)疾病發(fā)生機(jī)理3.生物制藥(1)疫苗生產(chǎn)(2)基因工程藥物生產(chǎn)(3)診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn)(4)細(xì)胞工程藥物生產(chǎn)第4頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用第5頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)

1.活細(xì)胞：能長時間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動

2.可控制：可選擇特定的研究細(xì)胞種類、性質(zhì)、階段

可控制調(diào)節(jié)條件：物理、化學(xué)、生物等因素可采用各種研究技術(shù)、記錄方法：

倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記等。

3.樣品均一性：來源于同一組織同一種細(xì)胞。4.經(jīng)濟(jì)、規(guī)模和機(jī)械化

第6頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞培養(yǎng)的局限性人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高,但人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際情況仍不完全相同。缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響。

當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后,生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，必然發(fā)生變化。第7頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五概念：原代與傳代原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。

傳代：細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。第8頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五第9頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式貼壁生長：必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實(shí)體組織來源細(xì)胞、上皮細(xì)胞。懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。第10頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五第11頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五第12頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五貼壁細(xì)胞第13頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五貼壁細(xì)胞第14頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五貼壁細(xì)胞第15頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五貼壁細(xì)胞第16頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五懸浮細(xì)胞第17頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境1、無污染環(huán)境：化學(xué)污染、微生物污染2、溫度環(huán)境：37℃。偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐受力較對高溫強(qiáng)，3、氣體環(huán)境：95%空氣加5%二氧化碳4、酸度環(huán)境：大多數(shù)細(xì)胞的適宜PH為7.2-7.4，細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些。5、細(xì)胞培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基。第18頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵1.實(shí)驗(yàn)材料的清洗、滅菌。2.無菌操作3.勤勞第19頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的理論背景設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制無菌技術(shù)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)與生長曲線凍存、復(fù)蘇與運(yùn)送常見問題及對策第20頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五實(shí)驗(yàn)設(shè)備與器材第21頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五CO2培養(yǎng)箱超凈工作臺

第22頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五倒置顯微鏡第23頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五濾器第24頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五電動移液器超純水儀第25頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五液氮罐第26頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿第27頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五實(shí)驗(yàn)器材的清洗和滅菌清洗的重要性1.除化學(xué)污染：鹽、油污、蛋白質(zhì)、重金屬等2.使培養(yǎng)瓶內(nèi)表面帶負(fù)電荷，供細(xì)胞附著。不要讓污染了的器皿變干！！滅菌的重要性除去微生物污染第28頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五酸液配方第29頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五新的玻璃器皿的清洗滅菌自來水刷洗，除去灰塵。烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。刷洗、烘干：泡鹽酸12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。泡酸、清洗：用酸液浸泡12小時，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來水沖洗10次，最后蒸餾水沖洗3-5次。烘干、包裝：移液管和滴管的尾端要塞入棉花。高壓滅菌烘干備用第30頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五使用后的玻璃器皿的清洗滅菌刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿立即用清水刷洗干凈自來水浸泡過夜，泡酸前用自來水沖洗干凈，烘干。泡酸、清洗：烘干后泡入酸液，12小時后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來水沖洗10次（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），過蒸餾水3次。烘干、包裝高壓滅菌烘干備用第31頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五金屬器皿金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75％酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好，高壓滅菌，再烘干備用。第32頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五橡膠和塑料刷洗、烘干：使用后立即用清水刷洗干凈自來水浸泡過夜，泡酸前用自來水沖洗干凈烘干。泡入5％鹽酸過夜。自來水沖洗10次，過蒸餾水3次烘干高壓蒸汽滅菌烘干備用滴管膠頭可用75％酒精浸泡5分鐘，紫外線照射消毒。第33頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五水、溶液、培養(yǎng)基水：超純水。

至少為三蒸水或去離子水。第34頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五需配制的溶液 平衡鹽溶液（PBS或D-Hank’s等）胰酶培養(yǎng)基第35頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五溶液除菌方式高壓蒸汽滅菌：平衡鹽溶液過濾除菌：不能高壓的溶液，如培養(yǎng)基、胰酶等第36頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染第37頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五合成培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。第38頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。

第39頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五血清中含有：①多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分第40頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56℃，30分鐘血清的除菌：購買高質(zhì)量的無菌血清。不要自己試圖對血清除菌。第41頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五常用培養(yǎng)基配制要領(lǐng)購買合成培養(yǎng)基干粉。仔細(xì)閱讀說明書，確定配制方法，是否需要添加其他成分，如NaHCO3、HEPES、谷氨酸鹽等。確保所有的成分完全溶解確保水足夠純（包括調(diào)節(jié)pH值用液）。過濾除菌后取10ml置于干凈的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)三天，如培養(yǎng)基無改變，方可繼續(xù)使用。第42頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)基配制方法

（GibicoDMEM為例）拆開包裝，將包裝中粉末倒入一個1L燒杯中。用水將包裝內(nèi)壁的粉末沖洗入燒杯中。加入3.7g碳酸氫鈉。加水至900ml。調(diào)pH值至7.4定容至一升過濾除菌過濾最后取10ml置于干凈的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)三天，如培養(yǎng)基無改變，則可繼續(xù)使用。臨用前加10％牛血清。第43頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)基過濾除菌裝置第44頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五第45頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)基過濾裝置使用方法用自來水徹底清洗裝置。用蒸餾水漂洗兩次。烘干（塑料濾器烘干溫度不可超過60度）正確安裝好濾膜和整個裝置，包裝。高壓滅菌。第46頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五其他試劑 胰蛋白酶液：0.25％胰蛋白酶＋0.02％EDTA，用平衡鹽溶液溶解，過濾除菌。平衡鹽：高壓滅菌。第47頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的理論背景設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制無菌技術(shù)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)與生長曲線凍存、復(fù)蘇與運(yùn)送常見問題及對策第48頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五無菌技術(shù)微生物污染一直是細(xì)胞培養(yǎng)的主要問題。第49頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五無菌技術(shù)總原則任何時候都要毫不動搖的在每一個操作環(huán)節(jié)都堅(jiān)持高標(biāo)準(zhǔn)的無菌技術(shù)！預(yù)防為主！不要讓無菌程度低的物品沾染無菌程度高的物品！！第50頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五無菌程度梯度示意圖第51頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)室的滅菌定期打掃培養(yǎng)室室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5％過氧乙酸擦拭。CO2培養(yǎng)箱滅菌：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過氧乙酸，再用紫外燈照射。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈，定期消毒。定期更換蒸餾水。實(shí)驗(yàn)前滅菌：打開紫外燈20-30分鐘實(shí)驗(yàn)后滅菌：用75％酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺，打開紫外線照射20-30min第52頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備：肥皂洗手。穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、穿好拖鞋戴乳膠手套，75％酒精擦手。第53頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五工作面無菌原則保持工作面干凈。使用前用75％乙醇充分擦洗工作面，打開紫外燈照射30分鐘。盡量少放物品：帶入必須的，移走不必要的。工作臺面內(nèi)物品整齊有序。實(shí)驗(yàn)完畢后移走所有物品，并徹底擦洗工作面，開紫外燈照射30分鐘。第54頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五正確的工作臺面布局物品在工作臺中部潔凈區(qū)圍成新月狀，酒精燈位于中央。第55頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五保持臺面整齊Good！Bad！第56頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五無菌操作凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面靠近酒精燈火焰操作。玻璃器具（滴管、移液管等）使用前必須過火滅菌打開和蓋上蓋子前后灼燒瓶頸和蓋口附近。無菌級別高的物品不能觸碰無菌級別低的物品。手不能從敞開的瓶口上方經(jīng)過各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。手握試管、滴管、移液管時盡量遠(yuǎn)離工作端。盡可能移走不需要的物品，在操作中經(jīng)常用酒精擦拭臺面。盡可能減少開蓋時間。隨時擦去任何溢出物。第57頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五無菌操作任何時候都不要把液體從一個無菌容器倒入另一個無菌容器。傾倒廢液時防止濺起和瓶口回流。

在視野范圍內(nèi)工作。第58頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五無菌技術(shù)每人準(zhǔn)備一套實(shí)驗(yàn)材料（器皿、溶液等），不可混用。無菌的思想貫穿到細(xì)胞培養(yǎng)的任何操作步驟。第59頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的理論背景設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制無菌技術(shù)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)與生長曲線凍存、復(fù)蘇與運(yùn)送常見問題及對策第60頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五原代培養(yǎng)細(xì)胞分離之后至第一次傳代之前的細(xì)胞培養(yǎng)階段。第61頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五原代培養(yǎng)策略第62頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五原代培養(yǎng)——分離小鼠胚胎第63頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五原代培養(yǎng)——分離雞胚第64頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五原代培養(yǎng)——酶解組織第65頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的理論背景設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制無菌技術(shù)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)與生長曲線凍存、復(fù)蘇與運(yùn)送常見問題及對策第66頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五概念——“代”細(xì)胞分裂一次？錯！培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。第67頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五傳代培養(yǎng)的要訣（一）該出手時就出手！

該換液時就要換液，該傳代時就要傳代！

否則，細(xì)胞就不是那個細(xì)胞

細(xì)胞會衰退、分化、生長緩慢…………，多數(shù)情況下很難扭轉(zhuǎn)和補(bǔ)救。第68頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五傳代培養(yǎng)的要訣（二）勤觀察每天肉眼觀察培養(yǎng)基顏色是否異常，有無混濁觀察培養(yǎng)基顏色變化速度是否異常：變化過慢意味著細(xì)胞生長過于緩慢；變化過快而細(xì)胞密度并不大，表明有污染的可能性。鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、生長速度。觀察培養(yǎng)箱水盤中的水是否干凈。觀察CO2壓力表。觀察液氮罐內(nèi)液氮體積第69頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五傳代培養(yǎng)的要訣（三）嚴(yán)格無菌操作輕柔：避免機(jī)械力損傷細(xì)胞，重懸細(xì)胞時盡量用50ml離心管，通過晃動離心管分散細(xì)胞，盡量避免過力吹打。離心力不可超過300g（普通臺式離心機(jī)水平轉(zhuǎn)子1000rpm）?？焖伲悍乐挂蜻^分小心導(dǎo)致操作時間過長，增加污染概率。第70頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五每代貼附生長細(xì)胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期平臺期第71頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五

每代貼附生長細(xì)胞的生長過程游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時貼壁期：血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）潛伏期：此時細(xì)胞有生長話動，而無細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時。對數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺期）細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。機(jī)制：接觸抑制、密度抑制。盡量避免細(xì)胞進(jìn)入平臺期。第72頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五何時換液？ pH降低。培養(yǎng)基顏色由紅變橙要警惕，變成黃色之前一定要換液。pH降至6.5時，細(xì)胞停止生長；降至6.0，細(xì)胞失去活性。無法挽救。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)衰退時須勤換液若培養(yǎng)物密度過低或者生長緩慢，則更換一半培養(yǎng)基。第73頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五貼壁細(xì)胞換液的操作 吸出或倒出舊培養(yǎng)基。加入同體積新培養(yǎng)基。第74頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五懸浮細(xì)胞換液操作 將培養(yǎng)液移入離心管中1000rpm×5min離心棄上清加入新培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。移入培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。第75頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五何時傳代？在對數(shù)生長末期傳代不可在潛伏期傳代第76頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五貼壁細(xì)胞何時傳代？ 細(xì)胞密度，90％匯合度。若繼續(xù)放置超過24h，細(xì)胞將脫離細(xì)胞周期，再接種需要很長時間才能恢復(fù)。須頻繁更換培養(yǎng)基時。理想的傳代頻率：1:2～1:4傳代，接種密度104～105/ml，每7天傳代一次。常規(guī)傳代最好依據(jù)嚴(yán)格的時間表進(jìn)行。第77頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五第78頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五第79頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五第80頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五第81頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五第82頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五第83頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五第84頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五貼壁生長細(xì)胞傳代方法（一）

吸盡培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。用PBS（或Hank’s）洗滌細(xì)胞兩次，吸光緩沖液。加入0.25％的胰蛋白酶液（0.1ml/cm2）到培養(yǎng)瓶細(xì)胞面對側(cè)。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使胰酶完全覆蓋細(xì)胞層，靜置2-10min（室溫或37度，顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測，至細(xì)胞變圓隆起）。加入含血清培養(yǎng)基以終止消化反應(yīng)。用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)基，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸液于離心管內(nèi)，1000rpm×5min離心，棄上清。加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。吸取適量細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。加適量新鮮培養(yǎng)基于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。將新培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第85頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五貼壁生長細(xì)胞傳代方法（一）

國內(nèi)廣泛使用的方法。缺點(diǎn)：1.消化時，瓶內(nèi)液體較多，液體振蕩的機(jī)械力會使細(xì)胞成片脫落，難以形成單細(xì)胞懸液。2.培養(yǎng)基消耗較多。3.耗時長。4.須將細(xì)胞液移入離心管操作，增大污染的概率。5.兩次吹打，對細(xì)胞機(jī)械損傷較大。第86頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五貼壁生長細(xì)胞傳代方法（二）第87頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五傳代步驟1.細(xì)胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3至1:6，依細(xì)胞種類而異。2.材料：2.1.PBS,2.2.trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：以10ml分裝于15ml無菌離心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回溫2.3.新鮮培養(yǎng)基2.4.無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶3.步驟：3.1.吸掉舊培養(yǎng)液。3.2.用D-PBS洗滌細(xì)胞一至二次。3.3.加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，離心后再吸掉上清液。)3.4.輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。第88頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五傳代操作要點(diǎn) 消化溫度：室溫或37℃均可。消化時間，不可太長（不超過10min），不可太短（須形成單細(xì)胞懸液）。防止細(xì)胞成片滑落。4℃消化，延長消化時間較容易獲得單細(xì)胞懸液。輕柔吹打，防止機(jī)械損傷。盡量避免刮傷培養(yǎng)瓶細(xì)胞貼附面（尤其是塑料培養(yǎng)瓶），否則影響觀察，且細(xì)胞貼壁不均勻。按時換液和傳代，不可拖延。第89頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五懸浮細(xì)胞傳代細(xì)胞密度：超過1×106/ml，需要頻繁更換培養(yǎng)基時。離心法傳代：離心（1000rpm×5min）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后混勻傳代。第90頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞傳代，什么最難？做一件好事不難，難的是做一輩子好事。傳一兩代細(xì)胞不難，難的是持續(xù)穩(wěn)定的傳十幾代、幾十代細(xì)胞，難的是持續(xù)穩(wěn)定的傳幾個月、幾年細(xì)胞。材料準(zhǔn)備、溶液配制、無菌操作、培養(yǎng)條件、傳代時機(jī)、傳代頻率、消化程度、吹打力度、接種密度……均要正確而穩(wěn)定。第91頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五建議正式開始實(shí)驗(yàn)前，練習(xí)細(xì)胞傳代培養(yǎng)至少2個月。第92頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的理論背景設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制無菌技術(shù)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)與生長曲線凍存、復(fù)蘇與運(yùn)送常見問題及對策第93頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五電子細(xì)胞計(jì)數(shù)器第94頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞計(jì)數(shù)板深度1mm，每個大方格是0.1mm3第95頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞計(jì)數(shù)操作制備單細(xì)胞懸液，吹打均勻后，轉(zhuǎn)移一小部分樣本（500ul）至1.5mlEP管中，加入等體積0.4％臺盼藍(lán)染液。75％酒精清洗計(jì)數(shù)板表面，注意不要劃傷計(jì)數(shù)表面。將已染色待測細(xì)胞懸液吹打均勻，然后用移液器吸取20ul細(xì)胞懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，液體剛好流到計(jì)數(shù)板凹槽邊緣。注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。將計(jì)數(shù)板平放在顯微鏡載物臺上計(jì)數(shù)。第96頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五第97頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五統(tǒng)計(jì)角上四個大格的活細(xì)胞數(shù)。對于壓線細(xì)胞的處理：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右細(xì)胞團(tuán)按照一個細(xì)胞計(jì)。結(jié)果計(jì)算：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝（四個大格子細(xì)胞數(shù)之和/4)×104×2

第98頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞計(jì)數(shù)的注意事項(xiàng) 制備單細(xì)胞懸液。不可有較多成團(tuán)細(xì)胞。取樣均勻。多次取樣計(jì)數(shù)取平均值。細(xì)胞密度：每mm2細(xì)胞數(shù)>100，一般100～300。若須精確定量，則應(yīng)在500～1000個。如細(xì)胞濃度不足，則離心后重懸于更小體積培養(yǎng)基中再重新計(jì)數(shù)。計(jì)算時注意稀釋倍數(shù)。避免樣品在槍頭中停留時間過長。將細(xì)胞注入計(jì)數(shù)池中時，注入的量不可過多，不可過少，不可產(chǎn)生氣泡。臺盼藍(lán)染色時間不可超過30分鐘。第99頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五生長曲線的繪制第100頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五生長曲線的繪制方法（略）取樣均勻。多次測量取平均值。第101頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五生長曲線的分析重要參數(shù)1.潛伏期時間2.倍增時間3.平臺期密度第102頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五生長曲線的分析第103頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五生長曲線的分析第104頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)的理論背景設(shè)備與器材準(zhǔn)備、溶液配制無菌技術(shù)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)與生長曲線凍存、復(fù)蘇與運(yùn)送常見問題及對策第105頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞凍存細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。第106頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過程中，對細(xì)胞最大傷害的是細(xì)胞內(nèi)水形成的冰晶。所以最重要的就是要減少冰晶的形成。1.慢凍快融2.加入細(xì)胞保護(hù)劑（DMSO、甘油等）第107頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。第108頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞保護(hù)劑——DMSO常用的低溫保護(hù)劑是二甲基亞砜（DMSO），它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。有毒！強(qiáng)滲透性。可以滲入乳膠手套。水DMSO第109頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞保護(hù)劑——DMSO使用濃度：5％～10％，一般用10％。復(fù)蘇時需1:20稀釋，從10％稀釋到0.5％。如果進(jìn)出細(xì)胞速度過快，會對細(xì)胞產(chǎn)生滲透性損傷。所以凍存和復(fù)蘇時要盡量降低細(xì)胞內(nèi)外DMSO的濃度差。DMSO與細(xì)胞混合后室溫下不能放置超過30分鐘溶于水時放熱，對細(xì)胞損害大。不能將純DMSO直接加入細(xì)胞懸液。少數(shù)細(xì)胞系對DMSO敏感，凍存時改用甘油。第110頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五滿足凍存標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)健康生長良好處于對數(shù)生長晚期無污染。第111頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五凍存液體條件細(xì)胞濃度至少1×106/ml，最好1×107/ml。溶液成分：40％血清＋10％DMSO＋50％合成培養(yǎng)基。血清含量越高，對細(xì)胞保護(hù)越好。含量最高可提高到90％。第112頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞凍存懸液的制備（一）預(yù)先配制凍存液：含10%血清培養(yǎng)基＋10%DMSO取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106～1×107/ml)1ml分裝于凍存管中，密封后標(biāo)記。按照冷凍程序凍存。第113頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞凍存懸液的制備（二）預(yù)先配制2×凍存液：含80%血清培養(yǎng)基＋20%DMSO制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度2×106～2×107/ml將細(xì)胞懸液預(yù)2×凍存液按1:1稀釋（直接稀釋即可。最佳方法：用槍吸取2×凍存液緩慢滴加入細(xì)胞懸液中，邊加邊搖動離心管）。1ml分裝于凍存管中，密封后標(biāo)記。按照冷凍程序凍存。第114頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞凍存懸液的制備（錯誤方法）制備單細(xì)胞懸液將1/10體積純DMSO加入細(xì)胞懸液中，混勻。1ml分裝入凍存管，凍存。第115頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五慢凍程序平均冷度速率：－1℃/min最大冷度速率－1.9℃/min第116頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五冷凍方法（一）將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2cm的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。第117頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五冷凍方法（二）先將凍存管放入4℃冰箱，約30min接著置于-20℃冰箱，約30-60min置于-80℃超低溫冰箱中放置過夜置于液氮罐中長期保存—20℃放置時間不可過長，否則細(xì)胞存活率低?？陕匀ミ@一步，4℃30min后直接放入-80℃超低溫冰箱第118頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五冷凍方法（三）將凍存管捆綁在一起，外層裹以厚層棉花，置于－80℃超低溫冰箱中放置過夜。置于液氮罐中長期保存第119頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五冷凍方法（四）將凍存管放于程序降溫盒中。將程序降溫盒置于－80℃超低溫冰箱中放置過夜。置于液氮罐中長期保存。第120頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五冷凍方法（五）程控冷凍柜第121頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞凍存的注意事項(xiàng)經(jīng)常檢查液氮灌中液氮的量。從-80度冰箱轉(zhuǎn)移到液氮灌中要非常迅速，如溫度超過-50度會顯著影響細(xì)胞活性。做好標(biāo)記和記錄非常重要?。。〉?22頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五凍存細(xì)胞的管理第一代第二代第二代第二代第二代第二代第三代第四代第三代第三代第五代第二代1.新到細(xì)胞為第一代，傳第二代時盡量多傳幾瓶、多凍幾管作為種子儲備（Seedingstock），留一瓶繼續(xù)傳代和使用。2.傳代和使用中也可以凍存一些低次代的細(xì)胞作為使用者儲備（Userstock）。3.傳代次數(shù)較多之后細(xì)胞可能已經(jīng)發(fā)生變化。盡量少用種子儲備。第123頁，共138頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞的復(fù)蘇方法從液氮中取出冷凍管，迅速放入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右），水面不可沒過蓋子，防止水污染細(xì)胞。注意，凍存管可能爆炸！培養(yǎng)液稀釋至原體積的20倍。滴加，10ml/2分鐘，先慢后快，邊加邊搖晃培