分子生物學實驗課解析第1頁/共58頁概述

基因克隆是70年代發(fā)展起來的一項具有革命性的研究技術(shù)，在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復制的載體DNA連接，然后將其轉(zhuǎn)入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程，因此基因克隆又稱分子克隆、基因操作或重組DNA技術(shù)。第2頁/共58頁概述基因克隆涉及一系列的分子生物學技術(shù)，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導入宿主細胞技術(shù)和重組子篩選技術(shù)等等基因克隆可概括為∶分、切、接、轉(zhuǎn)、篩。第3頁/共58頁第4頁/共58頁

質(zhì)粒質(zhì)粒（plasimid）是獨立于染色體以外的能自主復制的共價、雙鏈、閉合、環(huán)狀DNA分子。主要存在于細菌、真菌、放線菌中。第5頁/共58頁質(zhì)粒具有復制能力、轉(zhuǎn)移性及選則標記等基本特性，攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達。質(zhì)粒DNA的分離與純化是最常用、最基本的分子生物學實驗技術(shù)。第6頁/共58頁實驗一

質(zhì)粒DNA的分離純化第7頁/共58頁【實驗目的】了解提取質(zhì)粒的原理。學習和掌握質(zhì)粒提取的方法和技術(shù)。

——三個基本步驟：細菌的生長和質(zhì)粒的擴增菌體的收集裂解及質(zhì)粒DNA的釋放質(zhì)粒DNA的分離純化第8頁/共58頁裂解法：基于細菌染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復性差異?！緦嶒炘怼康?頁/共58頁【試劑與器材】超凈工作臺恒溫搖床高速離心機量筒、三角瓶、平皿、EP管、槍頭、LB培養(yǎng)基溶液I溶液Ⅱ

溶液Ⅲ

TE(pH8.0)第10頁/共58頁【實驗步驟】細菌的生長和質(zhì)粒的擴增菌體的收集裂解及質(zhì)粒DNA的釋放質(zhì)粒DNA的分離純化第11頁/共58頁細菌的生長和質(zhì)粒的擴增取一環(huán)冷凍保存的菌種（含pUC19）接種于LB固體平板（含Amp）上，倒置37℃過夜取單個菌落，接種于3-5mlLB液體培養(yǎng)基（含50g/mLAmp）中，37℃振蕩過夜第12頁/共58頁菌體的收集裂解及質(zhì)粒DNA的釋放取5ml菌液于生化管中，4500rpm5min，棄上清用STE液加至生化管2/3處，漂洗沉淀，4500rpm5min用STE液1.5ml轉(zhuǎn)入EP管，12000rpm5min加200uL冰預冷溶液I（強烈振蕩混勻完全分散菌體）加400uL溶液Ⅱ，快速溫和顛倒EP管4-6次，冰浴5min，（溶液變黏稠）加300uL冰預冷溶液Ⅲ，溫和顛倒混勻，冰浴5min，（白色絮狀沉淀）12000rpm，5min，上清轉(zhuǎn)至新EP管第13頁/共58頁質(zhì)粒DNA的分離純化加等體積氯仿（振蕩混勻），12000rpm5min,

上層水相轉(zhuǎn)至新EP管，重復一次加1/10體積3mol/LNaAc和2.5倍體積無水乙醇（充分混勻），-20℃10min，12000rpm10min，棄上清加1ml預冷70%乙醇（輕彈混勻），12000rpm5min,棄上清將EP管倒置于濾紙上，室溫敞口，10-15min加入50lTE，溶解沉淀，待用第14頁/共58頁注意事項

1.加入溶液I后，渦旋振蕩應充分打散菌體使之均勻懸?。?.加溶液Ⅱ裂解要完全(快速輕柔顛倒5-10次)，使蛋白質(zhì)和核酸變性；3.加溶液Ⅲ后pH要達到中性(輕柔振蕩5-10次)，使質(zhì)粒DNA復性，這樣才能使質(zhì)粒DNA與染色體DNA完全分開，否則，難分開。4.酚-氯仿抽提離心后，小心吸取上清，勿吸有機相。第15頁/共58頁溶液I

50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895×104Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘，保存于4℃。作用：分散菌體，鰲合金屬離子使金屬失活第16頁/共58頁溶液Ⅱ

0.2mol/LNaOH(從5mol/L貯存液中現(xiàn)用稀釋)1%SDS作用：細胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。第17頁/共58頁溶液Ⅲ

5mol/L乙酸鉀 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液中鉀的濃度為3mol/L，乙酸根的濃度為5mol/L作用：酸性條件下質(zhì)粒DNA復性，染色體DNA不能復性沉淀，高分子RNA沉淀。鉀離子與SDS、蛋白質(zhì)、膜形成復合物。第18頁/共58頁實驗二核酸的濃度和純度

測定與DNA的限制性酶切反應第19頁/共58頁【實驗目的】了解：紫外分光光度法測定核酸濃度和純度及DNA限制性酶切反應的原理。掌握：核酸濃度和純度的測定及DNA限制性酶切反應的方法和技術(shù)。第20頁/共58頁【實驗原理】紫外分光光度法測定核酸濃度和純度：組成核酸分子的堿基，均具有一定的吸收紫外線特性，最大吸收波長是260nm，在260nm波長的紫外線下，1個吸光度值相當于雙鏈DNA濃度為50ug/mL；單鏈DNA或RNA為40ug/mL?？梢越璐藖碛嬎愫怂岬臐舛?。通過測定在260nm和280nm的紫外線吸收值的比值(A260/A280)估計核酸的純度。第21頁/共58頁【實驗原理】DNA的限制性酶切反應：限制性內(nèi)切酶是有細菌自己產(chǎn)生的能識別雙鏈DNA分子中特定堿基序列，并以內(nèi)切方式水解雙鏈核酸中的磷酸二酯鍵的核酸水解酶。內(nèi)切酶可以分為三種類型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅱ型酶就是基因工程常用的水解酶，能識別具有特異核苷酸序列的雙鏈DNA，并在這個識別的特異核苷酸序列內(nèi)進行切割。第22頁/共58頁【實驗原理】DNA的限制性酶切反應：Ⅱ類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’);有的切割位點在對稱軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端,如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端。示意圖：第23頁/共58頁【試劑與器材】限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ及緩沖液

紫外分光光度計及石英比色皿第24頁/共58頁【實驗步驟】紫外分光光度法測定核酸濃度和純度：1.紫外分光光度計預熱20min；

2.吸取5uLDNA樣品，加水至1mL混勻，轉(zhuǎn)入石英比色皿；

3.在260nm和280nm，以蒸餾水調(diào)零，分別讀取“A”；4.計算：

雙鏈DNA樣品的濃度(ug/uL)=A260*稀釋倍數(shù)*（50/1000）=A260*（1000/5）*（50/1000）

=A260*10雙鏈DNA樣品的純度：A260/A280第25頁/共58頁【實驗步驟】DNA的限制性酶切反應：

1.取EP管,按下表依次加入下列試劑：

2.用封口膜封口，混勻，12000r/min離心2min，37℃

水浴過夜。試劑加樣量

10×Buffer

2uLDNA模板6-8ug內(nèi)切酶EcoRⅠ

1uL蒸餾水加至20uL第26頁/共58頁注意事項

1.A260/A280的比值可以反映核酸的純度。DNA和RNA純品的A260/A280的值分別為1.8和2.0.若為DNA樣品，比值大于1.8，說明仍有RNA，可以用RNA酶處理樣品；小于1.6，說明樣品中純在蛋白質(zhì)或酚，應再用酚-氯仿抽提。2.進行酶切時，要在其最適溫度下進行（多數(shù)為37℃）。3.每一種酶用專用緩沖液，緩沖液加入量為總體積1/10。4.酶切反應總體積為20uL,反應體系中，DNA模板最終量為6-8ug。第27頁/共58頁實驗三DNA的瓊脂糖凝膠電泳第28頁/共58頁【實驗目的】了解：瓊脂糖凝膠電泳的原理。掌握：瓊脂糖凝膠的制作及電泳的方法。第29頁/共58頁【實驗原理】瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖，溶解后鏈間的糖分子上的羥基由于氫鍵的作用相互連接，形成三維空間結(jié)構(gòu)，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。隨著瓊脂糖濃度的不同形成不同孔徑的凝膠，用于分離、純化相對分子質(zhì)量大小不同的DNA分子。DNA分子在pH高于其等電點的溶液中帶有負電荷，在處于電場的瓊脂糖凝膠中向正極泳動。不同的DNA分子在同一電場中的電泳速率不同，從而達到分離的目的。第30頁/共58頁【實驗原理】熒光嵌入燃料如溴化乙錠分子嵌入DNA分子中形成絡(luò)合物，由于溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，從而在紫外線下直接觀察DNA條帶在凝膠中的位置。第31頁/共58頁【試劑與器材】低熔點瓊脂糖（約65℃熔化

）5×TBE電泳緩沖液溴化乙錠（EB）穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀水平電泳槽及點樣梳溶液Ⅳ（加樣緩沖液）第32頁/共58頁【實驗步驟】1.配制0.7%低熔點瓊脂糖溶液；2.冷卻至55℃左右，加入EB（0.5ug/mL），搖動混勻；3.用膠帶圍封電泳板兩端，平置，插好點樣梳，將溫熱的瓊脂糖溶液倒入電泳板中，冷卻后放4℃冰箱10-20min；4.拔出梳子，撕去膠帶，將電泳板放入電泳槽中，加入0.5×TBE電泳緩沖液500mL;5.加5uL溶液Ⅳ于DNA樣品管中，混勻，取20uL混合液加入加樣孔中（潛水式加樣）；6.蓋上電泳槽蓋，接好電源線，打開電源開關(guān)，以1-5V/cm電壓電泳，7.在紫外分析儀的玻璃平板上觀察電泳結(jié)果。第33頁/共58頁注意事項

1、應在瓊脂糖應完全融化后制膠，倒膠時要避免產(chǎn)生氣泡，若有氣泡要用吸管吸去；2、EB為強誘變劑，有致癌作用；3、加樣孔容積決定最大加樣量，切忌加樣孔中樣品過多而溢出；4、采用低電壓、長時間電泳，可以得到分辨率較好、帶型整齊的電泳圖譜。第34頁/共58頁實驗四

DNA片段的回收與重組連接第35頁/共58頁【實驗目的】了解：DNA片段的回收與重組連接的原理。掌握：從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的方法及

DNA重組連接技術(shù)。第36頁/共58頁【實驗原理】DNA片段的回收：質(zhì)粒、噬菌體等經(jīng)酶切后，DNA片段需要純化。常將酶切產(chǎn)物電泳后，從凝膠中將合適大小的DNA片段進行回收和純化。第37頁/共58頁【實驗原理】DNA的重組連接：在Mg2+和ATP存在下，T4-DNA連接酶能催化載體分子的粘性末端與外源DNA的相同粘性末端聯(lián)接成重組DNA分子。聯(lián)接反應的影響因素包括溫度、時間、酶量、緩沖系統(tǒng)、DNA末端的性質(zhì)級濃度、DNA片段的大小等。第38頁/共58頁【試劑與器材】紫外分析儀T4DNA連接酶第39頁/共58頁DNA片段的回收：1.在紫外燈下，從凝膠中切下含有待回收DNA的膠條，大小片段分開放置于EP管中，65℃孵育5min，搗碎；2.加入300uLTE液，搖勻；3.用DNA分離純化的方法沉淀DNA。DNA的重組連接：1.10uL的反應體系中依次加入：目的DNA(小片段)3uL;載體（大片段）1uL;蒸餾水4uL；10×Buffer1uL；T4DNA連接酶1uL2.用封口膜封口，混勻，12000r/min離心2min，16℃反應過夜。【實驗步驟】第40頁/共58頁注意事項

1.紫外燈下切下待回收DNA的凝膠時，應盡量減小含目的DNA片段膠塊的體積，切割時間不超過30S；2.紫外燈下切下待回收DNA凝膠時，防止外源DNA的污染；3.為保證目的DNA片段裝載到載體上，最好目的DNA片段的分子數(shù)/載體分子數(shù)﹥3；4.連接酶的最佳反應溫度是16℃。第41頁/共58頁質(zhì)粒DNA的分離純化加等體積氯仿（振蕩混勻），12000rpm5min,

上層水相轉(zhuǎn)至新EP管，重復一次加1/10體積3mol/LNaAc和2.5倍體積無水乙醇（充分混勻），-20℃10min，12000rpm10min，棄上清加1ml預冷70%乙醇（輕彈混勻），12000rpm5min,棄上清將EP管倒置于濾紙上，室溫敞口，10-15min加入10l蒸餾水，溶解沉淀，待用第42頁/共58頁實驗五感受態(tài)細胞

的制備（CaCl2）與轉(zhuǎn)化第43頁/共58頁【實驗原理】CaCl2法制備感受態(tài)細胞的原理是：細菌處于0℃，CaCl2低滲溶液中，菌體細胞膨脹成球形，待轉(zhuǎn)化DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽復合物黏附于細胞表面，經(jīng)42℃短時間熱激處理，促進細胞吸收DNA復合物。在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，受體細菌分裂增殖，被轉(zhuǎn)化到細菌細胞中的重組子基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可篩選出所需的陽性轉(zhuǎn)化子。第44頁/共58頁【試劑與器材】DH5α菌0.1mol/LCaCl2溶液含氨芐青霉素（Amp）的LB瓊脂培養(yǎng)平板往復式恒溫搖床第45頁/共58頁【實驗步驟】受體菌的培養(yǎng)感受態(tài)細胞的制備（CaCl2法）質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化第46頁/共58頁受體菌的培養(yǎng)取一環(huán)冷凍保存的菌種（DH5α）接種于不含抗生素的瓊脂糖平板上，倒置37℃培養(yǎng)過夜取單個菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜第47頁/共58頁感受態(tài)細胞的制備（CaCl2法）取4mL菌液于5mL生化管中，冰浴10min，4℃下4000rpm離心10min，棄上清，吸去殘留液體加1.5mL冰預冷0.1mol/LCaCl2溶液，輕輕混懸細胞后轉(zhuǎn)入Ep管中，冰浴10min，4℃下4000rpm離心10min，棄上清，吸去殘留液體加200uL冰預冷0.1mol/LCaCl2溶液，混勻，冰浴10min，此細胞即為感受態(tài)細胞第48頁/共58頁質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化取上述感受態(tài)細胞，加入重組質(zhì)粒DNA溶液，輕輕混勻，冰浴30min放入42℃水浴中，準確計時90s（不要搖動Ep管），然后迅速將Ep管冰浴2min加入200uLLB液體培養(yǎng)基，于恒溫搖床（37℃）培養(yǎng)45min混勻菌液，用無菌棉拭子將菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基（含Amp），倒置平皿，37℃培養(yǎng)過夜第49頁/共58頁注意事項

1.42℃熱激是一個關(guān)鍵步驟，準確的熱激溫度和時間非常重要；2.低溫對Ca2+介導DNA的轉(zhuǎn)化是必須的，