分子生物學(xué)常用技術(shù)及其應(yīng)用第1頁/共71頁主要內(nèi)容基因工程重組DNA技術(shù)-基因工程核酸分子雜交技術(shù)PCR技術(shù)基因診斷與基因治療第2頁/共71頁

第一節(jié)

基因工程第3頁/共71頁基因工程的基本概念工具酶載體重組DNA技術(shù)的基本原理重組DNA技術(shù)的基本過程基因工程在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第4頁/共71頁一、基因工程的基本概念

DNA重組：不同來源的DNA分子可以通過末端共價(jià)連接而形成重新組合的DNA分子的過程?；蚬こ蹋簩⒒蜻M(jìn)行克隆，并利用克隆的基因表達(dá)、制備特定的蛋白或多肽產(chǎn)物，或定向改造細(xì)胞乃至生物個(gè)體的特性所用的方法及相關(guān)的工作。第5頁/共71頁二、工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶其它工具酶

1、DNA連接酶

2、DNA聚合酶

3、逆轉(zhuǎn)錄酶

4、多核苷酸激酶

5、堿性磷酸酶

6、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶第6頁/共71頁三、載體質(zhì)粒噬菌體粘粒病毒第7頁/共71頁四、重組DNA技術(shù)的基本原理

第8頁/共71頁五、重組DNA技術(shù)的基本過程目的基因的制備方法：

1、基因組DNA文庫

2、制備cDNA文庫

3、PCR4、化學(xué)合成第9頁/共71頁目的基因與載體的連接方法：

1、粘性末端連接

2、同聚物加尾連接

3、平末端連接

4、人工接頭連接第10頁/共71頁將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞方法：

1、轉(zhuǎn)化

2、感染第11頁/共71頁目的基因的篩選和鑒定方法：

1、遺傳學(xué)方法

2、分子雜交法

3、免疫學(xué)方法第12頁/共71頁克隆基因的表達(dá)第13頁/共71頁六、基因工程在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)的研究疾病的診斷和基因治療基因工程藥物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物人類基因組計(jì)劃蛋白質(zhì)工程第14頁/共71頁

第二節(jié)重組DNA技術(shù)-基因工程第15頁/共71頁重組DNA技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)展中最重要的成就之一。即是基因工程(GeneEngineering)的核心技術(shù)。重組DNA技術(shù)（RecombinantDNATechnique）是人類根據(jù)需要選擇目的基因（DNA片段）在體外與基因運(yùn)載體重組，轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞或生物體內(nèi)，以達(dá)到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的。這一技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，關(guān)鍵在于限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。

第16頁/共71頁

一、限制酶

限制性內(nèi)切核酸酶(restrictiveendonucleases)，又稱限制酶。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶（“分子手術(shù)刀”）。發(fā)現(xiàn)于原核生物體內(nèi)，現(xiàn)已分離出100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術(shù)和基因診斷中重要的一類工具酶。第17頁/共71頁1、限制酶的命名

根據(jù)其來源命名。如：

屬名菌株名

EcoRI

種名編號(hào)EcoRI來源于大腸桿菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。第18頁/共71頁2、限制酶識(shí)別序列和切割形成

每種限制酶能識(shí)別和切割的通常4～8個(gè)核苷酸序列，稱為限制性位點(diǎn)或切點(diǎn)。

如：HareⅢ5’-GGCC-3’

BamHI5’-GGATCC-3`

平末端(bluntend)對(duì)稱軸切，連接效果差切割形成粘性末端（stickyend）交錯(cuò)切。第19頁/共71頁第20頁/共71頁部分常用限制酶及切點(diǎn)第21頁/共71頁互補(bǔ)末端連接第22頁/共71頁產(chǎn)生相同序列的突出末端的不同片段

可有三種方式：

1)用同一種限制酶切割；2)用識(shí)別相同靶序列的不同限制酶切割；3)用識(shí)別不同靶序列但可產(chǎn)生一致的粘性末端的限制酶切割。第23頁/共71頁3、特點(diǎn)：

根據(jù)上述限制酶的特點(diǎn)，在基因工程和基因診斷中的重要用途：

1)不論DNA的來源如何，同一種限制酶切割后產(chǎn)生的粘性末端容易重新連接。因此可將不同種屬的DNA重組。如人和質(zhì)粒DNA等。

2)用于人類基因組的DNA分析，具特定的酶切位點(diǎn)。

3)Gene突變改變酶切位點(diǎn)的消失或新產(chǎn)生將改變酶切片段長度。應(yīng)用于限制性片段多態(tài)性分析。第24頁/共71頁二、基因運(yùn)載體及其選擇

載體（Vector）:將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。第25頁/共71頁載體具以下特征：1)分子量小，便于攜帶較大的DNA片段，能進(jìn)入宿主細(xì)胞并在其中增殖；2)有多種限制酶切點(diǎn)，每種限制酶最好只有單一切點(diǎn)；3)被切割后的載體，插入外源DNA后，不影響其復(fù)制能力，并有可選擇的標(biāo)記基因（如，抗藥基因）。常用的載體有：質(zhì)粒，λ噬菌體，粘粒，BAC，YAC，PI等。第26頁/共71頁（一）.質(zhì)粒plasmid

Plasmid獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。

PBR322

大腸桿菌

pSC101

Plasmidchromosome

COIEIplasmid革蘭氏陰性菌

pc194

scp12

真核生物-酵母質(zhì)粒

第27頁/共71頁常用的質(zhì)粒如pUC19，多連接子MCS。插入外源基因片段長度約10kb。將外源基因插入到MCS中，隨質(zhì)粒的表達(dá)而表達(dá)，增殖而擴(kuò)增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性喪失而不顯蘭色-白色菌落。如果不插入外源基因，則產(chǎn)生蘭色。從而篩選陽性菌落。

EcoRIHindIIIOri復(fù)制起點(diǎn)LacZAPRpUC19第28頁/共71頁

（二）.λ-噬菌體(λphage)是一種可在體外包裝的細(xì)菌病毒,可高效感染大腸桿菌.λ-噬菌體DNA是線狀雙鏈DNA分子,全長約50kb,每條鏈各帶12bp長的單鏈互補(bǔ)末端-粘末端(COS序列)。進(jìn)入宿主細(xì)胞后不久，COS序列堿基配對(duì)環(huán)化。改建后的λ噬菌體發(fā)展了多種較大型的克隆載體，如：第29頁/共71頁1、置換λ載體–

溶解途徑載體和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。2、插入λ載體–

裂解途徑

DNA在宿主細(xì)胞中復(fù)制，然后包裝成噬菌體，裂解宿主，釋放噬菌體?？煽寺?kb的cDNA。第30頁/共71頁裂解途徑第31頁/共71頁（三）.粘粒(cosmidvector)

（30～40kb）

是將質(zhì)粒和λ噬菌體改建的一種載體.它含COS序列,插入一小plasmid–而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和cos末端。全長8kb。大片段外源DNA插入后，在體外包裝進(jìn)而被克隆?？砂b30～45kb長的DNA片段，多用于基因文庫構(gòu)建。

第32頁/共71頁(四)大片段DNA克隆載體

人類和哺乳動(dòng)物的基因組很大，甚至許多單個(gè)基因也相當(dāng)大（如：DMDgene2300kb），克隆分析就需要更大的基因載體。如近年來構(gòu)建的一些載體：BAC，PI，YAC等。第33頁/共71頁1、細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome,BAC）

優(yōu)點(diǎn)：能攜帶大片段DNA，約300kb。在每個(gè)細(xì)胞中，一個(gè)載體分子能繁殖多個(gè)拷貝，高產(chǎn)DNA。缺點(diǎn)：會(huì)出現(xiàn)插入片段在結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定，導(dǎo)致克隆DNA部分的缺失或重排。為克服上述缺點(diǎn)，人們采用低拷貝數(shù)復(fù)制子載體，如，Ecoli中的F因子。此質(zhì)粒含有2種基因（partA,partB）。每個(gè)Ecoli能接受>300kbDNA片段。第34頁/共71頁2、噬菌體PI載體和PAC

PI噬菌體與λ噬菌體一樣，外有蛋白質(zhì)殼。內(nèi)含相當(dāng)大的（110～115kb）線性DNA，并在體外包裝于PI殼內(nèi)。PI進(jìn)入宿主細(xì)胞后環(huán)化，擴(kuò)增。1994年，有人將PI和F因子克隆結(jié)合產(chǎn)生PI人工染色體克隆系統(tǒng)-----PAC。第35頁/共71頁3、酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）適用于克隆大片段DNA，0.2～2Mb第36頁/共71頁YAC的主要功能成份有三：

1）著絲粒：mitosis姊妹染色單體和減I同源染色體分離之必需。2）端粒：保護(hù)染色體末端免受核酸酶的侵襲。3）自主復(fù)制序列（ARS）元件：是染色體自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。構(gòu)建YAC需要4個(gè)短序列：2個(gè)端粒，著絲粒，ARS元件，與外源DNA連接成線性DNA分子，導(dǎo)入酵母細(xì)胞克隆。第37頁/共71頁三、DNA重組與分子克隆化

為獲得所需的基因或特異序列，需從細(xì)胞中分離得到目的基因與載體DNA重組，并用適當(dāng)方法在宿主細(xì)胞中表達(dá)，擴(kuò)增得到大量相同的DNA片段，稱為DNA克隆，亦稱分子克隆。第38頁/共71頁

基本原理與過程：

1、分離純化目的基因

2、目的基因+vector=重組DNA分子

3、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在其內(nèi)增殖。

4、篩選含有重組DNA的細(xì)胞——細(xì)胞克?。╟ellclone），將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞置于瓊脂表面，以刺激細(xì)胞克隆生長，這些細(xì)胞是由單個(gè)細(xì)胞形成的遺傳相同的細(xì)胞群體，故稱細(xì)胞克隆。再將每個(gè)克隆移至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。

5、分離重組DNA克隆：即收獲擴(kuò)增的培養(yǎng)細(xì)胞，并選擇分離重組DNA。第39頁/共71頁分離純化目的基因

目的基因+vector=重組DNA分子

第40頁/共71頁重組DNA

和分子克隆

第41頁/共71頁重組DNA和分子克隆的幾種方法：

（依目的基因的來源）

1、從基因組中分離目的基因在細(xì)胞中克隆

2、由特定mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后再進(jìn)行克隆

3、化學(xué)合成目的基因進(jìn)行克隆

4、PCR體外擴(kuò)增目的片段進(jìn)行克隆第42頁/共71頁從基因組中分離目的基因在細(xì)胞中克隆

第43頁/共71頁篩選含有重組DNA的細(xì)胞——細(xì)胞克?。╟ellclone）

第44頁/共71頁篩查含有目的基因的細(xì)胞克隆第45頁/共71頁四、目的基因表達(dá)

上述細(xì)胞的克隆系統(tǒng)可直接導(dǎo)入的目基因擴(kuò)增，獲得足夠量的目的基因來進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能的研究。重組DNA技術(shù)的另一目的是獲得基因重組后的產(chǎn)物——RNA，蛋白質(zhì)。就是將目的基因與表達(dá)載體重組，導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)而表達(dá)出相應(yīng)的基因產(chǎn)物（蛋白）。如胰島素，干擾素；生產(chǎn)疫苗的抗原和特異的抗體等。此類克隆系統(tǒng)稱為表達(dá)克隆。（expressioncloning）.第46頁/共71頁目的基因表達(dá)

第47頁/共71頁（一）真核細(xì)胞的基因在原核細(xì)胞

（細(xì)菌）中表達(dá)

原核細(xì)胞中缺乏真核基因表達(dá)裝置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表達(dá)。通常采用大腸桿菌為宿主。真核多肽的表達(dá)要求：

1）適當(dāng)?shù)腸DNA（完整的編碼序列）；

2）適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，提供特定多肽信息；

3）外部進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，表達(dá)系統(tǒng)設(shè)計(jì)有啟動(dòng)子。

產(chǎn)物特征：

1）真核細(xì)胞的蛋白由于不能羥基化而不穩(wěn)定；

2）活性受限或無活性。第48頁/共71頁(二)真核細(xì)胞基因在真核細(xì)胞中表達(dá)

真核宿主細(xì)胞提供一個(gè)相似但又不相同的環(huán)境。常采用酵母或昆蟲細(xì)胞作為宿主。應(yīng)用于真核細(xì)胞蛋白質(zhì)的大量制備，研究特定基因的表達(dá)。產(chǎn)物翻譯后羥基化，羧基化等，有加強(qiáng)蛋白的穩(wěn)定和功能活性。第49頁/共71頁

五、基因文庫基因文庫（genelibrary）,應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的含有基因組的全部基因的DNA克隆。第50頁/共71頁（一）

構(gòu)建基因組DNA文庫第51頁/共71頁（二）染色體特異的基因文庫

（chromosomespecificlibrary）

單個(gè)染色體→細(xì)胞克隆

（流式C儀）↓細(xì)胞→染色體

染色體文庫

染色體區(qū)帶→區(qū)帶特異

（顯微切割）↓

DNA文庫

第52頁/共71頁

（三）cDNA文庫（cDNAlibrary）

cDNA文庫構(gòu)建：特定組織細(xì)胞一定發(fā)育階段總mRNA第53頁/共71頁核酸分子雜交技術(shù)

第三節(jié)第54頁/共71頁一、分子雜交的原理

DNA雙鏈分子加熱變性解鏈后，如控制好條件，緩慢降溫，兩條鏈之間可以根據(jù)堿基互補(bǔ)的方式再重新形成雙鏈。（復(fù)性）如把不同的DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對(duì)關(guān)系，就可在不同的分子間形成雜化雙鏈，這就叫核酸分子雜交。第55頁/共71頁用途研究DNA分子中某一種基因的位置，兩種核酸分子間的相似性即同源性;

也可用于檢測(cè)某些專一序列在待檢樣品中的存在與否等。第56頁/共71頁二、分子雜交的基本方法Southern印跡雜交Northern印跡雜交斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交原位雜交第57頁/共71頁三、探針技術(shù)1、探針（probe)：一小段已知序列的用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)記它的末端或全鏈的多聚核苷酸鏈。2、探針技術(shù)：將探針與固定在NC膜上的DNA或RNA進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，探針的序列如果與NC膜上的核酸序列相互補(bǔ)，就可以結(jié)合到膜上的相應(yīng)區(qū)帶，經(jīng)放射自顯影或其他檢測(cè)手段就可以叛斷膜上是否有同源的核酸分子存在。第58頁/共71頁

第四節(jié)PCR技術(shù)第59頁/共71頁何謂PCR？是體外有引物介導(dǎo)的特定DNA序列的酶擴(kuò)增反應(yīng)。