關(guān)于質(zhì)粒的提取和純化第1頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六內(nèi)容一.質(zhì)粒的概念和提取原理二.堿裂解法的實驗操作和原理三.煮沸法快速提取質(zhì)粒的實驗操作和原理四.實驗室使用的方法五.質(zhì)粒純化后的檢測第2頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六一.質(zhì)粒的概念和提取原理質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中,它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄要依賴于宿主細(xì)胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì),如離開宿主細(xì)胞則不能存活,而宿主即使沒有它們也可以正常存活.第3頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六一.質(zhì)粒的概念和提取原理質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型:

緊密控制型(Stringentcontrol)

松馳控制型(Relaxedcontrol)第4頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六一.質(zhì)粒的概念和提取原理在pH12.0~12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒DNA。第5頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六實驗中使用的三個溶液1,溶液Ⅰ：

葡萄糖—使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部.

Tris.Cl(pH8.0)—提供反應(yīng)的最佳環(huán)境.EDTA(pH8.0)—Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑,抑制DNase(脫氧核糖核酸酶)的活性和抑制微生物生長.

第6頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六實驗中使用的三個溶液2,溶液Ⅱ：NaOH(臨用前用10mol/LNaOH

母液稀釋)1％SDS

注:要新從濃NaOH稀釋制備NaOH，是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性.NaOH細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化,瞬間就溶解.當(dāng)然SDS也是堿性的,但是很弱,只能抽提得到少量質(zhì)粒.第7頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六實驗中使用的三個溶液3,溶液Ⅲ：KAc冰醋酸ddH2O注:冰醋酸的作用是為了中和過量的NaOH.KAc是提供K+和SDS反應(yīng),取代Na離子,形成十二烷基硫酸鉀(PDS),而PDS是難溶于水的.SDS易和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了,同時長長的基因組DNA也一起被共沉淀了.但是SDS并不與DNA分子結(jié)合.第8頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六二，堿裂解法的操作步驟1,取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的含質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液,高速離心,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。

2,加入溶液I,充分懸浮菌體細(xì)胞。

3,加入新配制的溶液II,蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴5分鐘。

4,加用冰預(yù)冷的溶液III,搖動離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物,冰上放置15分鐘,此時應(yīng)形成白色絮狀沉淀。

5,4℃下離心15分鐘。

第9頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六二，堿裂解法的操作步驟6,取上清液,加入RNA酶A,37℃水浴20分鐘。

7,加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4℃下高速離心10分鐘。

8,取上層水相,加入等體積氯仿,振蕩混勻,4℃下高速離心10分鐘。

9,取上層水相,加入2倍體積的無水乙醇,室溫放置幾分鐘,離心。

10,4℃下高速離心15分鐘,沉淀用數(shù)ml70%冰冷乙醇洗滌,4℃下高速離心5分鐘。

11,吸除上清液,將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡,真空干燥10分鐘或室溫干燥。

12,得到的質(zhì)粒樣品一般用TE緩沖液或者ddH2O進行溶解.第10頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六注意的事項一,在加溶液Ⅱ后:①.時間不能過長，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；②.必須溫柔混合,不然基因組DNA也會斷裂。二,加入的酚必須要用氯仿和乙醇洗滌干凈,否則對后面的實驗有影響.三,沉淀DNA也可用異丙醇(一般使用等體積),且沉淀完全,速度快,但常把鹽沉淀下來,所以多數(shù)還是用乙醇。四,提取質(zhì)粒DNA過程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好,要將蛋白盡量除干凈需多次抽提.

第11頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六三，煮沸法快速提取質(zhì)粒的操作步驟（1）將2ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基加入到容量為15ml的試管中，接種一單菌落，用棉塞封口，在37℃劇烈震蕩（250rpm）培養(yǎng)過夜。

（2）將1.5ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入離心管中，在4℃條件下離心30秒。

（3）棄上清液，用濾紙吸干離心管中的液體培養(yǎng)基，將細(xì)菌沉淀物懸浮于200mlSTET緩沖液（8%蔗糖，0.5%Triton,50mmol/LEDTA,,10mmol/LTris）

，用渦旋混合器充分混勻。

（4）加入4ml新鮮配制的溶菌酶液，混勻，置室溫下5min。

（5）用漂子架住離心管，置于沸水浴中，精確記時45秒，取出后立刻離心10min。

第12頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六三，煮沸法快速提取質(zhì)粒的操作步驟（6）用無菌牙簽挑取離心管中的沉淀物棄去，離心管的上清液中加入8ml5%CTAB(十六烷基三甲基溴化氨)，用混合器混勻后，高速離心5min，棄上清液，用濾紙吸干離心管中的液體。

（7）加入1.2M氯化鈉300ml，充分溶解沉淀物，再加入750ml的冷乙醇，充分混勻后，離心15min，棄上清液。

（8）取1ml70%冷乙醇，緩慢淋洗離心管內(nèi)壁，離心5min。棄上清液，用濾紙吸干管壁上的液體，置室溫中使核酸沉淀自然干燥5-10min。

（9）沉淀物溶于50mlTE緩沖液中，混合器混勻。

（10）即成質(zhì)粒制備液，制備的質(zhì)粒供下一步實驗使用.第13頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六四，實驗室使用的操作步驟1,取1.5ml含細(xì)菌的培養(yǎng)液,離心,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。2,加入溶液I,充分懸浮菌體細(xì)胞。

3,加入新配制的溶液II,蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴5分鐘。4,加用冰預(yù)冷的溶液III,搖動離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物,冰上放置15分鐘,此時應(yīng)形成白色絮狀沉淀。5,4℃下離心15分鐘。第14頁，共16頁，2023年，2月20日，星期六四，實驗室使用的操作步驟6,取上清液加新的離心管中.7,加入純化樹脂,混勻,放置10min.8,將溶液轉(zhuǎn)移到離心純化柱中,高速離心.9,倒掉下管中的溶液,再加80%異丙醇,洗滌兩次,每次離心