酵母菌的離純化、固化和酒精發(fā)第部酵菌分純一、實目的應(yīng)用酵母菌的生理生化和生態(tài)學(xué)的特點從自然環(huán)境中分離酵母菌并掌握微生物分離純化的基本方法。二、實原理酵母菌常見于含糖份比較高的環(huán)境中，如果園土、菜園土及果皮等的表面。多數(shù)酵母菌喜歡偏酸條件適pH為4.5-6.0.母菌生長迅速易分離培養(yǎng)。在液體培養(yǎng)基中，酵母菌比霉菌生長快，利用酸性條件則可以抑制細菌的生長。因此常用酸性液體培養(yǎng)基獲得酵母菌的加富培養(yǎng)后在固體培養(yǎng)基上劃線分離純化。三、器和用品1、甘蔗、蘋果皮、葡萄皮、果園土、菜園土等。2、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯（煮開10min后過濾取汁葡萄糖瓊脂20g，水1000ml，pH自然。分裝三角瓶；試管斜面支/組3、乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液：配方同上，不加瓊脂加乳酸，1000ml培養(yǎng)基加入5ml乳酸，pH為5.5左右，再分裝試管ml2支/組。4、無菌吸管3支/組、無菌培養(yǎng)皿、100ml菌水1瓶/組、涂棒、美蘭染液、顯微鏡、接種環(huán)等。四、實方法1、接種：取果皮（不需沖洗）或土5克，加入到00ml無菌水中，充分?jǐn)嚢韬?，用無菌吸管取1入到9ml酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，28-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，可見培養(yǎng)液變渾濁。2、加富培養(yǎng)：無菌吸管上述養(yǎng)液1，注入另1管乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，在28-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。3、鏡檢：用無操作法用種環(huán)少量液置于載玻片上，中央滴一滴美蘭染液混合均勻后制成水浸片在高倍鏡下觀察酵母菌的形態(tài)及出方式并可根據(jù)菌體是否染色來區(qū)分酵母菌的死活細因活細胞使美蘭染液還原故菌體不著色。4涂皿用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基溶化后制成平板用無菌吸管取.1ml加富培養(yǎng)液到平板中，用涂棒涂勻后培養(yǎng)2。5、分離純化：接種環(huán)挑取單個酵母菌菌落，在平板上四區(qū)劃線，培養(yǎng)后

分離得到單個菌落。6、鏡檢：挑取單菌落，制片觀察其形態(tài)。7、菌種保藏：種酵母菌馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，長出菌苔后冰箱保藏。第部酵菌固化術(shù)一實驗?zāi)康?.了解固定化細胞的原理。2.掌握用海藻酸鈉制備固定化酵母細胞的方法。二實驗原理固定化細胞技術(shù)是指用物理或化學(xué)的手段將游離細胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持催化活性、反復(fù)使用的方法。優(yōu)點：細胞密度高、反應(yīng)速度快、耐毒害能力強、產(chǎn)物分離容易、可反復(fù)使用、能實現(xiàn)連續(xù)操作，可大大提高生產(chǎn)能力。用于生產(chǎn)各種胞外產(chǎn)物，包括酒精酒類、氨基酸、有機酸、酶、輔酶、抗生素。細胞固定化的方法有多種如吸附法交聯(lián)法和包埋法等。吸附法：叫載體結(jié)合法據(jù)帶電的微生物細胞和載體之間的靜電面張力和黏附力的作用，使細胞固定在載體表面和內(nèi)部；簡便，活力損失??；但細胞與載體作用力小，易脫落交聯(lián)法：利用雙功能或多功能試劑，直接與細胞表面的反應(yīng)基團（如氨基酸、羥基、咪唑基等）發(fā)生反應(yīng)，使其彼此交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化細胞，其結(jié)合力是共價鍵。此法制備麻煩，活力損失較大；但細胞與載體結(jié)合較緊包埋法：分為凝膠包埋法和半透膜包埋法膠包埋法是將細胞包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中而使細胞固定透膜包埋法是將細胞包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)。簡單，條件溫和，穩(wěn)定性好，包埋細胞容量高。工業(yè)上常用包埋法固定微生細胞。海酸鹽是種廣泛應(yīng)用的固定化介質(zhì)，具有化學(xué)穩(wěn)定性好、無毒、包埋效率高且價格低廉等優(yōu)點海藻酸鈉呈溶液狀時將細胞加入混勻然后在氯化鈣中凝固形成海藻酸鈣凝膠凝膠顆粒中的微小空格將細胞固定海藻酸鈣凝固的顆粒能反復(fù)使用細胞在空格中可以新陳代謝（固定活細胞)。三實驗材料1、分離的酵母菌。2、培養(yǎng)基：酵母膏蛋白20g，葡糖30g蒸餾水，pH自然，115℃滅菌20min。3試劑0.2mol/L氯鈣液150ml/（22.2g氯化鈣蒸餾水1000mL

2%海酸鈉50ml/瓶稱取一定的海藻酸鈉加入無菌燒杯中，先加少量水調(diào)成糊狀，在不足水份適當(dāng)加熱融化。4、器具：200ml無燒杯1個、璃棒1根無射器1個（20ml菌吸管1支，無菌水200ml/三角瓶、10ml培基試管1支、200ml三角瓶培養(yǎng)基1個、青霉素、天平、紗布、細繩、電爐培養(yǎng)箱、棉塞等。四實驗步驟1、將酵母菌接入10ml培養(yǎng)基中,于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后待用。2取3ml酵母菌培養(yǎng)（預(yù)熱到35℃左右加入到50ml2%海藻鈉溶液中（冷卻45℃左右均勻混后用射器吸制成小球滴mol/L氯化鈣溶液中，攪拌成珠（固定酵母3待凝膠珠在氯化鈣溶液中浸泡30min后用蒸餾水洗滌固定酵母2次后，再轉(zhuǎn)入到滅過菌的200mL液體培養(yǎng)基中（其加入1mg青霉素4、將固定酵母于28℃靜置培養(yǎng)3天后觀，可見培養(yǎng)基中有大量的CO2氣泡產(chǎn)生，嗅氣味有酒香；用刀片切開固定酵，鏡檢可見大量密集的酵母菌。第部酵菌酒發(fā)一實驗?zāi)康?.掌握酵母菌生產(chǎn)酒精的方法。2.了解酒精發(fā)酵的主要類型及其控制條件。二實驗原理在厭氧條件下糖分解為乙醇并放出二氧碳的作用為酒精發(fā)酵作用。酒精發(fā)酵的類型有三種即通過EMP途徑的酵母菌酒精發(fā)酵通過HMP途徑的細菌酒精發(fā)（即異型乳酸發(fā)酵和通過ED途徑的細菌酒精發(fā)酵在工業(yè)酒精和各種酒類的生產(chǎn)中，酒精發(fā)酵的主要作用是由酵菌來完成的。酵母菌通過EMP徑分解己生丙酮在厭氧和微酸性條，丙酮酸繼續(xù)分解為乙醇但是如果在堿性條件下或在培養(yǎng)基中加入亞硫酸時產(chǎn)物主要是甘油這就是工業(yè)上的甘油發(fā)酵因此如果酵母菌要進行酒精發(fā)酵就必須控制發(fā)酵液在微酸性條件下。三實驗材料1、菌種：分離的酵母菌。2、培養(yǎng)基：白糖（糖80g(NHSO2.0gKH1.0gHO1000mlpH自然115℃424242滅菌20min。150ml三角瓶裝述培養(yǎng)50ml250ml角瓶裝培養(yǎng)基100ml，大試中裝一個注滿培養(yǎng)基的杜氏小管，再裝入10ml培基。

3、試劑：10%NaOH、1%KCrO242274、器材：三角瓶個、三角1個、大試1支、杜、無菌吸管1支。接種環(huán)、培養(yǎng)箱、100mL量筒紗、繩天平、棉塞3個。四實驗步驟1、取分離的酵母種一，接150ml三角瓶中，于28-30℃培養(yǎng)中培養(yǎng)24h作為液體種子上述液體種子以5%的接種量分別接入的三角瓶和大試管中，在于28-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2，后觀察結(jié)果。2、二氧化碳生成的檢驗1）觀察三角中的酵液無泡沫或氣泡出，觀察發(fā)酵試管中的杜小管中有無氣體聚集。2）取10%NaOH溶液ml注入發(fā)酵試管內(nèi)，輕輕搓動發(fā)酵管，觀杜小管內(nèi)液面是否上升，如氣體逐漸消失，則證明氣體發(fā)酵過程中產(chǎn)生的二氧化碳。3、酒精生成的檢驗：1）打開發(fā)酵瓶塞子，嗅聞有無酒精味；2）取發(fā)酵5ml加入試管，10%HSO溶液ml；向試管中滴1%KO溶液2422710～20滴；如管內(nèi)由橙黃色變?yōu)辄S綠色，證明有酒精生成。2KCrO+SO+3CHOH→3CHCOOH+SO+(SO)(黃綠色+O2