哮喘患病及危險因素的研究第1頁/共29頁ERCC1codon118單核苷酸多態(tài)性與草酸鉑敏感性的關(guān)聯(lián)性研究第2頁/共29頁

前言

大腸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病及死亡率較高的惡性腫瘤。近年來我國的大腸癌發(fā)生率也呈逐年上升趨勢。遺傳、飲食、腸道內(nèi)微生態(tài)失衡等因素可能與其發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。早期治療的大腸癌一般預后良好，但對于進展期大腸癌患者，大多數(shù)治療效果不盡人意。故探求新的有效治療手段對挽救進展期大腸癌患者生命和提高生存質(zhì)量具有重要意義。第3頁/共29頁

草酸鉑（Oxaliplatin）是新一代鉑類抗腫瘤藥物，具有抗癌譜廣，毒副作用小等優(yōu)點，尤其可以用于有效治療進展期大腸癌。然而由于臨床用藥的盲目與濫用，無論單獨還是聯(lián)合應用，草酸鉑的目標有效率也僅為20%-35%。因此，提高草酸鉑使用的有效性及安全性，降低耐藥性的相關(guān)研究逐漸受到普遍關(guān)注。第4頁/共29頁

鉑類藥物的細胞毒作用主要歸因為鉑原子與細胞內(nèi)DNA特異位點結(jié)合形成的鉑-DNA加合物產(chǎn)生鏈間交聯(lián)或鏈內(nèi)交聯(lián)，抑制DNA復制轉(zhuǎn)錄，導致細胞死亡。故其藥物抵抗性與腫瘤細胞DNA損傷修復能力密切相關(guān)。草酸鉑因具有1，2二氨基環(huán)己烷（DACH）結(jié)構(gòu)，與DNA鏈中的鳥氨酸形成的DACH-Pt-DNA加合物更易誘導參與核苷酸切除修復（NER）途徑的酶類，啟動NER。第5頁/共29頁

NER過程涉及包括識別DNA損傷位點，切開受損的DNA鏈，合成并連接DNA鏈，以取代切除的寡核苷酸等，大約18-25個活性因子在其中發(fā)揮作用。第6頁/共29頁

切除修復交叉互補集團1基因（ERCC1）編碼的ERCC1蛋白是NER途徑中的關(guān)鍵因子.ERCC1與XPF形成一異源二聚體:ERCC1-XPF，具有重要的結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶活性，在雙鏈DNA交界處酶促5’端裂解，損傷的寡核苷酸可被切除。ERCC1蛋白表達水平的差異，可能直接影響到細胞的DNA損傷修復能力。第7頁/共29頁

誘導ERCC1蛋白表達，增加細胞的DNA修復損傷能力是一把“雙刃刀”。一方面受損的DNA修復系統(tǒng)會增加發(fā)生腫瘤的危險性，這在肺癌、頭頸腫瘤等惡性腫瘤的病因?qū)W研究中得到證實。另一方面ERCC1表達降低則難以清除鉑-DNA加合物，增加腫瘤細胞對鉑類藥物的敏感性也是不爭的事實。因此,ERCC1蛋白表達缺陷會降低細胞的DNA損傷修復能力，可能致使細胞對草酸鉑敏感性升高。第8頁/共29頁

據(jù)報道ERCC1基因存在著兩個常見的單核苷酸多態(tài)性,其中一個位于第4外顯子118密碼子（ERCC1codon118SNPs）,盡管這是一種保守的同義核苷酸突變（AAT→AAC），兩者皆編碼絲氨酸,但有人認為該SNP不同基因型可能通過改變ERCC1蛋白表達水平而導致腫瘤細胞對于草酸鉑敏感性的差異,故將ERCC1codon118SNPs作為判斷草酸鉑治療進展期腸癌療效的一個遺傳預測標記。第9頁/共29頁

研究目的:

*證實ERCC1蛋白表達水平與草酸鉑敏感性的關(guān)聯(lián)*闡明ERCC1蛋白在草酸鉑細胞毒性機制的作用*構(gòu)建兩種包含ERCC1codon118SNP表達載體，獲得穩(wěn)定表達ERCC1不同基因型蛋白的轉(zhuǎn)染細胞系*比較ERCC1codon118SNP不同基因型對ERCC1蛋白表達水平、細胞DNA損傷修復能力及對草酸鉑敏感性的影響

第10頁/共29頁材料與方法

細胞系

中國倉鼠卵巢細胞系（CHO）:AA8（CHO野生型）

UV20（CHO突變型，ERCC1表達缺失）

DMEM培養(yǎng)基，37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

第11頁/共29頁方法:

構(gòu)建兩種包含ERCC1codon118SNP

的基因型T/T或C/C的質(zhì)?？俁NA提取及cDNA合成PSQTMDNA短序列分析ERCC1SNP基因型ERCC1基因擴增及目的片段的回收Gateway?定向克隆技術(shù)構(gòu)建ERCC1表達載體第12頁/共29頁Gateway?定向克隆技術(shù)構(gòu)建ERCC1表達載體示意圖第13頁/共29頁2、不同ERCC1SNP的表達載體轉(zhuǎn)染UV20細胞

轉(zhuǎn)染細胞可在含10%G418的DMEM培養(yǎng)基選擇生長，次日調(diào)G418濃度為5%，五日后，在熒光顯微鏡下根據(jù)是否可見表達綠色熒光蛋白細胞，確定是否轉(zhuǎn)染成功及轉(zhuǎn)染效率。

每次轉(zhuǎn)染實驗設(shè)立無DNA的空白對照組，以保證實驗結(jié)果的特異性第14頁/共29頁3、蛋白提取及Westernblot檢測ERCC1表達獲得3種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系UV20-ERCC1(C/C)或

UV20-ERCC1(T/T)及UV20-GFP,聚丙稀凝膠電泳法定性檢測ERCC1蛋白表達

4、檢測各轉(zhuǎn)染細胞ERCC1mRNA水平

實時-定量PCR法5、PSQTMDNA短序列確定轉(zhuǎn)染細胞基因型

第15頁/共29頁6、SRB法測定草酸鉑的細胞抑制率

7、細胞克隆實驗分析草酸鉑細胞毒性

8、改良彗星實驗檢測草酸鉑所致DNA損傷9、Rad51免疫熒光實驗評價草酸鉑所致DNA損傷及修復第16頁/共29頁結(jié)果1、ERCC1入門載體及表達載體的構(gòu)建、酶切鑒定及測序分析

ERCC1入門載體pDONR-ERCC1(3150bp)可選擇生長于含1%卡那霉素培養(yǎng)基平板，質(zhì)粒純化后，用PstⅠ進行限制性酶切，得到533bp和2617bp的預期片段。

ERCC1表達載體pIRES-GFP-ERCC1(6626bp)可選擇生長于含1%氨芐青霉素培養(yǎng)基平板經(jīng)HindⅢ酶切后可獲1227bp,5039bp片段,而經(jīng)BglⅡ酶切后可獲891bp,5735bp片段。第17頁/共29頁2、ERCC1在UV20細胞中的表達圖1，ERCC1不同SNP轉(zhuǎn)染細胞與UV20的FITC熒光圖象比較（╳100）第18頁/共29頁3、Westernblot驗證ERCC1在各細胞系中表達

38kDERCC1圖2，WesternBlot檢測ERCC1蛋白表達第19頁/共29頁4、轉(zhuǎn)染細胞ERCC1的SNP確定

第20頁/共29頁5、不同細胞ERCC1mRNA水平比較

AA8、UV20以及三種轉(zhuǎn)染細胞ERCC1mRNA水平差別具有統(tǒng)計學意義.（F=664.06,P=0.00）ERCC1缺乏細胞UV20和UV20-GFP均無ERCC1表達（LSD,P=0.732）。兩種ERCC1SNPs轉(zhuǎn)染細胞ERCC1表達接近.（LSD,P=0.648）

第21頁/共29頁6、草酸鉑的細胞抑制率測定及細胞克隆實驗結(jié)果

圖4，各細胞草酸鉑染毒后SRB細胞抑制率測定結(jié)果第22頁/共29頁圖5，各細胞草酸鉑染毒后細胞克隆實驗結(jié)果第23頁/共29頁圖7，草酸鉑染毒后細胞培養(yǎng)24h兩種轉(zhuǎn)染細胞彗星實驗圖象（╳100）

第24頁/共29頁7、改良彗星實驗測定各細胞DNA損傷修復程度

第25頁/共29頁第26頁/共29頁圖9，ERCC1不同SNPs轉(zhuǎn)染細胞草酸鉑處理后24h免疫熒光圖象（╳100）第27頁/共29頁討論ERCC1基因存在著兩個常見的單核苷酸多態(tài)性有報道認為ERCC1codon118SNP擁有T/T基因型的卵巢癌細胞系與ERCC1mRNA水平降低相關(guān),有人將ERCC1codon11819007T>CSNP作為判斷草酸鉑治療進展期腸癌療效的一個遺傳預測標記。但與此相反，通過對31例進展期腸癌分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，T/T基因