人外周血淋巴細胞彗星試驗檢測水體遺傳毒性的研究摘要：應用人外外周血淋巴細細胞彗星試驗驗對無錫充山山水廠、中橋橋水廠，常州州西石橋水廠廠進出水及金金壇市擬用水水源地長蕩湖湖湖心水樣的的遺傳毒性進進行了研究。結(jié)結(jié)果表明各水水樣的有機濃濃集物均可對對人外周血淋淋巴細胞DNA產(chǎn)生不同程程度的損傷，存存在一定的遺遺傳毒性。試試驗結(jié)果與各各水樣水質(zhì)污污染狀況基本本一致。同時時，季節(jié)變化化以及常規(guī)水水處理過程對對水樣的遺傳傳毒性有影響響。研究表明明彗星試驗可可有效地用于于檢測水體有有機濃集物遺遺傳毒性。關鍵詞：飲用水水，遺傳毒性性，人外周血血淋巴細胞，彗彗星試驗GenotoxxicityyevalluatioonofwaterrinhhumanperippherallblooodlymmphocyytesuusingtheccometassayyAbstracct:Thhegennotoxiicpottentiaalsoforgannicpoollutaantsiinsouurceaandtaapwattersaamplessoftthreewaterrworkss（i.e.,Chonggshan,,ZhonggqiaoandXXishiqqiao）andwaterrsamppleoffChanngdanggLakeewereeevalluateddwithhthecomettassaay.ThheressultsshoweedthaatDNAAdamaagesiinhummanpeeripheeralbbloodlymphhocyteeswerreindducedafterrexpoosuretothheorgganicextraactsffromaallwaaterssampleesanddthegenettichaazardexistted.TThecooncorddancebetweeenthheressultsooftheecomeetasssayanndtheepolllutionncondditionnsofthewwatersourcceswaasdissplayeedwelll.Mooreoveer,thheressultsindiccatedtheaalternnatesseasonnsandthewwatertreattmentproceesscoouldaaffecttthequaliityoffwateer.Thheressultsofthhissttudyddemonsstrateethattthecomettassaaycannbessuccesssfulllyapppliedtothhegennotoxiicitymonittoringgproggramooftheewateer.Keyworrds:ddrinkiingwaater，genottoxiciity，humannperiipheraalblooodlyymphoccyte，comettassaay飲用水與人體健健康直接相關關。自從70年代初美國國環(huán)保局首次次在水中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)氯的衍生物物以來，水中中有機物對人人體健康的影影響已日益引引起人們關注注。據(jù)1995年的數(shù)據(jù)，全全世界已在水水中測出有機機化合物2221種，其中許許多具有致癌癌、致畸和致致突變作用。國國內(nèi)也有相關關的報道，研研究發(fā)現(xiàn)黃浦浦江水中有機機物達700種，而用GC／MS法測得第二二松花江吉林林江段水中有有機物317種，其中不不乏致癌、致致突變物[11]。因此，有有研究認為，對對人體健康和和人口素質(zhì)的的影響而言，水水源中是否含含有遺傳毒性性的物質(zhì)，應應該是估價水水源水質(zhì)的主主要指標[22]。由于此此類有機物大大都呈現(xiàn)低劑劑量長期暴露露的特點，常常規(guī)的理化分分析不足以對對水質(zhì)狀況作作全面的評價價，所以建立立一種有效的的測試方法評評價水中有機機物的遺傳毒毒性是環(huán)境監(jiān)監(jiān)測工作中的的一項重要任任務。對于水體有機物物污染的遺傳傳毒性評估，一一般都采用體體外短期生物物測試系統(tǒng)進進行，如Ames試驗、微核核試驗、V79細胞致突突變試驗等。近近年來，彗星星試驗由于其其快速、敏感感、可靠等諸諸多優(yōu)點正越越來越多地在在這方面得到到廣泛的應用用[3]。本文文采用人外周周血淋巴細胞胞彗星試驗，對對無錫充山水水廠、中橋水水廠，常州西西石橋水廠進進出水及金壇壇市擬用水源源地長蕩湖湖湖心水樣的遺遺傳毒性進行行了研究。1材料和方法法1.1試驗材材料健康人外周肝素素抗凝全血，采采自南京市中中心血庫。1.2水樣的的采集與處理理于2003年44月采集無錫錫充山水廠、中中橋水廠進出出水，2003年7月和12月分別采集集常州西石橋橋水廠進出水水及長蕩湖湖湖心水樣。其其中，無錫充充山水廠、中中橋水廠水源源地位于太湖湖梅梁灣，常常州西石橋水水廠水源地為為長江，長蕩蕩湖為常州金金壇市擬用水水源地。各采采樣點采樣量量均為20L。水樣靜置24hr，過濾去除除懸浮顆粒，通通過XAD-2樹脂吸附柱柱富集，控制制流速在30-400mL/min，N2排除水分，以以甲醇、丙酮酮、二氯甲烷烷洗脫，洗脫脫液用氮吹儀儀在50℃條件下濃縮縮，吹干，再再用二甲基亞亞砜（DMSO）溶解，定定容至2.0mL，避光保存存于-18℃冰箱中備用用。1.3人外周周血淋巴細胞胞的分離與染染毒將新鮮肝素抗凝凝血按血量1/3加入3％的新配明明膠溶液于離離心管內(nèi)混勻勻，立即垂直直置于37℃恒溫水浴，自自然沉降約30min。吸取淡黃黃色淋巴細胞胞層0.2mL于事先裝有0.8mLLPBS緩沖液的微微量離心管中中，3000rrpm離心3min，棄去上清清，加入0.9mLLPBS及0.1mL水樣濃集物物，37℃避光染毒1hr。每個水樣樣設三個劑量量（即相當于于原水樣20mL、100mL、500mLL/管）。染毒毒后3000rrpm離心3min，棄上清，沉沉積細胞置4℃冰箱中備用用。同時作DMSO溶劑對照。用用苔盼藍染色色觀察細胞存存活率。1.4彗星試試驗彗星試驗方法參參照Singgh報道[4]。鋪好好膠層的玻片片在冷細胞裂裂解液裂解1hr后，在堿堿性電泳液（pH＝13.0）靜置，解解旋30min。調(diào)節(jié)節(jié)電壓為25V，電流為100mA，電泳1hr。以上各各步驟應在紅紅光或黃光下下進行，以免免產(chǎn)生額外的的DNA損傷。電泳泳后，經(jīng)中性性緩沖液中和和，在24hr內(nèi)，每張玻玻片以50μL溴乙錠（EB）染色，熒熒光顯微鏡下下觀察，進行行顯微攝影。3.2.3結(jié)果果評價及統(tǒng)計計分析采用彗星圖像分分析軟件CoometAAssaySoftwwarePProjecct(CAASP)，以以彗尾DNAA含量（TailDNA%%，TD），彗尾長長（TailLengtth，TL）以及Olive尾矩（OliveeTaillMomeent，OTM，即彗尾DNA含量×彗星頭尾部部密度重心間間距離）等三三個評價參數(shù)數(shù)對DNA損傷進行定定量分析。每每玻片至少分分析50個細胞。根據(jù)數(shù)據(jù)的分布布特征和方差差，以Mann–WhitnneyU檢驗驗比較各劑量量組與溶劑對對照間的損傷傷差異?？紤]慮到高劑量的的染毒可能造造成DNA的嚴重損傷傷，而使大量量的DNA游離斷片在在電泳過程中中丟失而引起起可測DNA損傷的降低低[5]，而劑劑量過低可能能使組間差異異難以充分表表現(xiàn)，所以本本文以100mLL/管這一劑量量對各水樣間間的遺傳毒性性進行多重比比較。由于OTM同時反映了了彗尾中DNA含量和彗尾尾形狀特征，所所以組間的多多重比較以OTM為指標，采采用Krusshal–WalliisH檢驗法，顯顯著性水平設設為0.05。2結(jié)果與分析析典型彗星圖像如如圖1、2所示。無錫錫充山水廠、中中橋水廠進出出水，常州西西石橋水廠進進出水及長蕩蕩湖湖心水樣樣有機濃集物物對人外周血血淋巴細胞DNA損傷的結(jié)果果分別見表1和表2。苔盼藍染色色法的結(jié)果表表明，各水樣樣不同劑量組組染毒前后細細胞存活率均均>90％，所以引引起DNA損傷的主要要為遺傳毒性性，而非細胞胞毒性。從表1中可以看看出，與溶劑劑對照相比，除除充山水廠和和中橋水廠出出水的低劑量量組（20mL/管）在TD這一指標上上無統(tǒng)計差異異外，其它各各水樣濃集物物均有極顯著著差異(P<0..01)，且隨著劑劑量的加大，受受損的程度也也加重。以OTM為評價指標標，在100mLL/管這一劑量量進行比較發(fā)發(fā)現(xiàn)各水樣間間無統(tǒng)計學差差異（P>0.005）。圖1DMSO溶劑對照組人外周血淋巴彗圖1DMSO溶劑對照組人外周血淋巴彗星圖像（×400）Fig.1Cometfigureofhumanperipheralbloodlymphocytestreatedwithsolventcontrol(DMSO)（×400）圖2充山水廠出水有機濃集物500mL/管劑量組人外周血淋巴彗星圖像（×400）Fig.2Cometfigureofhumanperipheralbloodlymphocytestreatedwiththeorganicextracts(500mL/tube)fromtapwaterofChongshanWaterwork（×400）表1無錫充山山水廠、中橋橋水廠進出水水（2003.4）有機濃集集物對人淋巴巴細胞DNA的損傷Table11DNAdamaggesinnhumannperiipheraalblooodlyymphoccytesexpossedtooorgaaniceextracctsfrromsoourceandttapwaateroffChonngshann,Zhoongqiaaowatterworrks(22003.44)水樣染毒劑量（ml/L）TailDNNA（％）Tailleength（μm）OliveTTailMMomentt充山水廠進水208.65±0..62**11.51±00.76***1.34±0..12**10014.63±11.10***18.35±11.33***3.19±0..40**50028.23±11.68***35.43±22.70**8.32±1..12**充山水廠出水207.93±0..6810.31±00.87**1.25±0..14**10013.60±00.81***15.36±00.90**2.19±0..17**50022.23±11.61***26.01±22.04**5.41±0..691**中橋水廠進水208.58±0..48**10.25±00.55***1.27±0..11**10013.21±11.07***19.54±11.24***2.76±0..31**50028.47±33.15**25.26±22.86**5.56±0..70**中橋水廠出水207.62±0..8510.79±11.20***1.45±0..26**10012.63±11.535***13.95±11.20**2.06±0..30**50018.05±11.03***17.74±11.13**3.24±0..32**溶劑對照06.65±0..397.81±0..400.86±0..06注：1.數(shù)據(jù)據(jù)均以mean±±S.E.MM表示;2.**:PP<0.01。從表2中可以看看出，與溶劑劑對照相比，除7月西石橋進水和12月長蕩湖湖心水樣的低劑量組（20mL/管）在TD這一指標上無統(tǒng)計差異外，其它各水樣濃集物均有顯著或極顯著差異(P<0.05，P<0.01)，且隨著劑量的加大，受損的程度也加重。同時，多重比較的結(jié)果表明，7月份對人血淋巴細胞DNA損傷程度大小順序為長蕩湖湖心水樣、西石橋水廠出水>西石橋水廠進水，12月份長蕩湖湖心水樣>西石橋水廠進水>西石橋水廠出水（P<0.05）。同時，比較兩次不同時間的水樣可知，季節(jié)變化變化對水質(zhì)影響顯著，其中7月份西石橋水廠進水對人血淋巴細胞DNA損傷程度極顯著（P<0.01）小于12月份進水，長蕩湖湖心水樣7月份顯著（P<0.05）小于12月份，而西石橋水廠出水水質(zhì)7月份大于12月份，但無統(tǒng)計學差異。表2常州西西石橋水廠進進出水、長蕩蕩湖湖心水樣樣（2003..7，2003..12）有機濃集物物對人淋巴細細胞DNA的損傷Table22DNAdamaggesinnhumaanperripherralblloodllymphoocytessexpoosedttoorgganicextraactsffromssourceeandtapwwaterofXiishiqiiaowaaterwoork,aandwaaterssampleeofCChangddangLLake((2003..7,20003.122)水樣染毒劑量（mL/管）TailDNNA（％）Tailleength（μm）OliveTTailMMomentt７月份西石橋水廠進水水207.08±0..4311.39±00.58***1.29±0..10**10011.48±00.63***13.89±00.71***1.89±0..14**aa50015.90±11.48***18.42±11.83***3.01±0..53**西石橋水廠出水水209.84±0..69**11.40±00.71***1.49±0..13**10015.88±00.99***19.53±11.18***2.83±0..21**bb50030.81±44.50**31.85±66.38***6.62±1..49**長蕩湖湖心水樣樣208.66±0..92*10.14±11.16***1.25±0..15**10016.16±11.19***18.77±11.36***2.93±0..28**bb50031.79±22.84***30.56±22.54**7.51±0..98**12月份西石橋水廠進水水209.57±0..30**18.33±00.57***1.78±0..07**10012.19±00.63***22.06±11.04***2.80±0..26**bb50015.38±00.98***30.33±11.80***4.59±0..48**西石橋水廠出水水207.86±0..34*12.25±00.52***1.31±0..08**1009.70±0..55**14.68±00.81***1.95±0..31**aa50016.57±00.79***29.95±11.57***4.26±0..36**長蕩湖湖心水樣樣207.21±0..5412.32±00.77***1.50±0..16**10016.79±00.65**25.25±00.96***3.92±0..26**cc50032.26±11.10***46.47±11.89***10.17±00.60***溶劑對照06.65±0..397.81±0..400.86±0..06注：1.數(shù)據(jù)據(jù)均以mean±±S.E.MM表示；*：P<0.055，**:P<0.012.以1000mL/管進行組間間比較，相同同字母表示樣樣本間無差異異，顯著性水水平為0.05；以100mL//管這一劑量量組比較各水水廠進出水可可知，無錫充充山水廠和中中橋水廠進水水對人淋巴細細胞DNA的損傷程度度均高于其出出廠水，但無無統(tǒng)計學差異異（P>0.05）；常州西西石橋水廠12月份進水對對人淋巴細胞胞DNA的損傷程度度高于出廠水水（P<0.05），而7月份進水低低于出廠水（P<0.05）。3討論長江江蘇段干流流水質(zhì)總體較較好，水質(zhì)符符合地表水環(huán)環(huán)境質(zhì)量III類標準。無錫錫充山、中橋橋水廠都位于于太湖北部梅梅梁灣,目前該水水域的生態(tài)環(huán)環(huán)境惡化已經(jīng)經(jīng)成為太湖最最主要的生態(tài)態(tài)環(huán)境問題，水水質(zhì)類別為劣劣Ⅴ類。長蕩湖為為太湖流域第第三大湖泊，目目前水質(zhì)基本本滿足Ⅲ類標準，水水體營養(yǎng)狀況況為中營養(yǎng)，但但近年來水質(zhì)質(zhì)也在逐漸變變差。人淋巴巴細胞彗星試試驗的結(jié)果與與以上各水樣樣的污染狀況況基本相符。目前，水廠一般般采用絮凝、沉沉淀、沙濾、炭炭濾和氯消毒毒等常規(guī)處理理工藝來生產(chǎn)產(chǎn)自來水[66]。研究表表明，氯化消消毒可產(chǎn)生多多種副產(chǎn)品，其其中不乏具有有致癌、促癌癌和致突變作作用的物質(zhì)，從從而使出廠水水的致突變性性增高[7]],[8]]。馬梅等[66]對不同原原水及不同水水處理工藝流流程出水有機機濃集物進行行的致突變試試驗表明，加加氯處理后可可生成一些直直接致突變性性物質(zhì)及某些些經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化化后形成的致致突變性物質(zhì)質(zhì)，機械攪拌拌和絮凝不太太可能改變致致突變性的狀狀況，而在此此之后的煤砂砂池和炭濾池池能夠有效地地去除加氯和和絮凝過程中中生成的致突突變性物質(zhì)。邱邱志群等[99]認為，當當水源水致DNA損傷物質(zhì)的的本底值較高高時，混凝沉沉淀對它的去去除作用更為為明顯，從而而使出水致突突變性降低。由于無錫市兩水廠以太湖梅梁灣（水質(zhì)相對較差）為水源水，而常州西石橋水廠以長江（水質(zhì)相對較好）為水源水，同時考慮到水質(zhì)的季節(jié)變化（統(tǒng)計分析表明7月份進水的致突變性極顯著地低于12月份進水，P<0.01），所以結(jié)果與以上報道是相符的。自1988年SSingh提出堿性電電泳法以來，各各國對彗星試試驗的應用研研究幾乎呈指指數(shù)式增長，在在遺傳毒性研研究、臨床應應用、DNA修復研究、環(huán)環(huán)境生物監(jiān)測測、人群監(jiān)測測等領域得到到廣泛應用[[10]。人人血淋巴細胞胞是彗星試驗驗最常用的生生物材料之一一，應用也最最為廣泛，如如人群流行病病學調(diào)查，環(huán)環(huán)境監(jiān)測、臨臨床應用（如如疾病診斷、藥藥效評估、病病因與發(fā)病機機理分析等）[11]。Rajaguru等曾將人血淋巴彗星試驗應用于受污染地表水的檢測，表明其在環(huán)境評價中有良好的應用前景[12]。本實驗室曾利用其評價揚中市地表水的污染狀況[13]。本文研究也證實了其用于檢測水體有機濃集物遺傳毒性的可行性。然而，由于彗星試驗程序尚未標準化，限制了其在實踐中的推廣應用，所以有必要進一步加強彗星試驗的方法學研究。4結(jié)論（1）無錫充山山水廠、中橋橋水廠，常州州西石橋水廠廠進出水及金金壇市長蕩湖湖湖心水樣的的有機濃集物物均可對人外外周血淋巴細細胞DNA產(chǎn)生不同程程度的損傷，存存在一定的遺遺傳毒性。試試驗結(jié)果與各各水樣水質(zhì)污污染狀況基本本一致。同時時，季節(jié)變化化以及常規(guī)水水處理過程對對水樣的遺傳傳毒性有影響響。（2）彗星試驗驗可有效地應應用于水中有有機物遺傳毒毒性的檢測，在在環(huán)境監(jiān)測中中有良好的應應用前景，但但有必要對其其進行標準化化以利于實踐踐中的推廣應應用。參考文獻：[1]朱惠剛剛.水中有機機致突變物綜綜合評價指標標探討[J]].上海環(huán)境境科學，1995,14(10):44-449[2]馮霄,,陸壽珍,陳中孚.SSOS顯色法檢測測黃浦江不同同江段水中有有機污染物的的遺傳毒性[[J].復旦學報(自然科學版),19900,29(22)：198-2202[3]RojjasE，LopezzMC，ValveerdeMM.Sinngleccellggelellectroophoreesisaassay::methhodoloogyanndappplicattions[J].JChhromattogrBB,19999,7222:2255–254[4]SinnghNP,MccCoyMMT,TTiceRRR,eetal..AsiimpletechnniqueforqquantiitatioonoflowllevelssofDDNAdaamageininndividdualccells[J].ExpCCellRRes,11988,175:1184-1991[5]DevvauxAA,PessonenM,MoonodGG.Alkkalineecomeetasssayinnrainnbowttrouthepattocytees[J]].ToxxicolinViitro,1997,,11:711~79[6]馬梅，尚尚瑋，王子健健等.飲用水處處理流程中有有機提取物的的毒性變化規(guī)規(guī)律[J]..環(huán)境科學,2001,22(l):49-552[7]馬軍..氯化消毒毒副產(chǎn)物的形形成及對飲用用水質(zhì)的影響響[J].中國給水排排水,19966,12(6):36--37[8]黃君禮禮,李海波,毛寧.二氧化氯氯和液氯消毒毒飲用水致突突變性的比較較[J].環(huán)境化學,1998:17(4):3881-387