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TECHNOLOGYappliedmicrobiology■bioconversion/biocatalysis■biofuels■biologicalengineer!ng■biologicalwastetreatment■biomass■公證手稿與氯化銨浸漬相關(guān)的新型預(yù)處理方式陳鴻章，李冠華，李洪強(qiáng)PII：S0960-8524（13）01741-0DOI：/10.1016/j.biortech.2013.11.025參考：BITE12645出現(xiàn)在：生物資源技術(shù)收稿日期：2013年9月10日修訂日期：2013年11月4日接受日期：2013年11月10日引用此文章為：陳，H.,李，G.,李，H.,與氯化銨浸漬相關(guān)的新型預(yù)處理方式，生物資源技術(shù)（2013年），DOI：/10.1016/j.biortech.2013.11.025這是一個已經(jīng)被接受發(fā)表的PDF文件原始稿件。作為手稿的早期版本。這份手稿是進(jìn)行審稿，排版，以及回顧之前發(fā)布其最終形式的證明。請注意，在發(fā)表過程中可能會產(chǎn)生些許錯誤，這可能會影響其內(nèi)容，所有的法律免責(zé)條款適用于有關(guān)雜志。與氯化銨浸漬相關(guān)的新型預(yù)處理方式陳鴻章，李冠華，李洪強(qiáng)生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，過程工程研究所，中國科學(xué)院，中國，北京，郵編100190摘要提高氮含量和酶水解是涉及到纖維素乙醇生產(chǎn)的關(guān)鍵工序，用NH4C1預(yù)浸后進(jìn)行蒸汽爆炸(SE)并對其試驗(yàn)后的氮含量，酶消化性和乙醇產(chǎn)量影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明，預(yù)處理后樣本中氮含量會增加，這可以作為乙醇發(fā)酵的氮源。通過90g/lNH4CI預(yù)浸漬并以1.4MPaSE的樣本最高葡萄糖產(chǎn)量為62.64%，相比于未處理樣品和只通過1.4兆帕SE處理的樣本分別高出2.1和0.2倍的效果。相比于未處理樣品和只通過1.1MPaSE處理的樣本，通過135g/lNH4Cl預(yù)浸漬并以1.1MPaSE的樣本乙醇產(chǎn)量分別高出1.93和0.69倍的效果。這種新型預(yù)處理方式相較于常態(tài)下的處理極大的提高了氮含量和酶消化性，建議進(jìn)一步的運(yùn)用于工業(yè)化生產(chǎn)。關(guān)鍵詞：蒸汽爆炸，氯化銨預(yù)浸漬，酶解，生物量，乙醇。*通訊作者.電話：+861082627071，傳真：+861082627064電子郵件地址：hzchen@(H.Z.陳)簡稱：SE,蒸汽爆炸;SERS，稻草汽爆;URS，未經(jīng)處理的稻草。1.簡介全球氣候變暖和化石燃料的枯竭導(dǎo)致了能夠減少對化石燃料儲量依賴的可替代、可再生能源越來越受到人們的關(guān)注(Moriarty&Honnery,2012).由于木質(zhì)纖維素的大量存在，生物乙醇產(chǎn)品成為最有前途的生物燃料，這吸引了來自于政府和私人組織的大量關(guān)注(Sarkaretal.,2012).廣泛的研究和試驗(yàn)工廠的試生產(chǎn)為木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的進(jìn)一步調(diào)研和優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)(Chen&Li,2013).一般來說，木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇包含兩個步驟：經(jīng)水解將多糖轉(zhuǎn)化成單糖和通過發(fā)酵將單糖轉(zhuǎn)化成乙醇(Limayem&Rieke,2012).天然木質(zhì)纖維素因其具有高度的抗水解結(jié)構(gòu)導(dǎo)致不能自然進(jìn)行酶水解。(Jeohetal.,2007).但人們已作出努力通過各種預(yù)處理來破壞復(fù)雜的抗水解結(jié)構(gòu)，而釀酒酵母的培養(yǎng)和發(fā)酵顯然已能夠達(dá)到相應(yīng)氮水平(Casey&Ingledew,1986).然而，稻稈公認(rèn)屬于營養(yǎng)缺乏型(Lauetal.,2008.).因此，額外的營養(yǎng)補(bǔ)充被視為不可避免的。酵母粉，蛋白胨，銨鹽和尿素總是被應(yīng)用于工業(yè)原料。雖然有機(jī)氮源中富含的肽和游離氨基酸，但成本太高。銨常常代替有機(jī)氮源，但營養(yǎng)很差。蒸汽爆炸(SE)是最有效的預(yù)處理方法之一，由于只需要較低的化學(xué)品使用量和能源消耗已被應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)(Chen&Liu,2007),蒸汽爆破可以結(jié)合物理撕裂或化學(xué)降解對材料進(jìn)行影響。在快速減壓過程中飽和蒸汽能穿透秸稈的毛孔并撕裂大量的氣孔，而材料在化學(xué)高溫狀態(tài)下會使其半纖維素和木質(zhì)素得到降解。由此,我們可以得出的結(jié)論是銨鹽可以通過物理或是化學(xué)方式參與到材料的預(yù)處理過程中來。因此，建議在蒸汽爆炸前進(jìn)行氯化銨的預(yù)浸。眾所周知氯化銨是強(qiáng)酸弱堿鹽，其溶液的pH值是弱酸性。以前的研究已經(jīng)表明，在酸性條件下我們可以通過高溫來提高半纖維素的解聚(Martinetal.,2002.).相較于SO2和h2so4,nh4cl的腐蝕性和刺激性較小。更重要的是，在木質(zhì)纖維素材料中摻入銨鹽，在高溫下其中的一些糖醛酸與木聚糖會因酯交聯(lián)而發(fā)生氨解反應(yīng)(Wangetal.,1967;Bartonetal.,1986).通過比較加入氯化銨預(yù)浸漬后蒸汽爆炸的結(jié)果，可知氯化銨預(yù)浸漬能增強(qiáng)預(yù)處理效果，這是可能是因?yàn)殇@可以轉(zhuǎn)化為其它類型的氮源存在，這有利于乙醇發(fā)酵。據(jù)我們所知，很少有研究將蒸汽爆炸和氮添加工藝結(jié)合起來，所以首先我們需要評估蒸汽爆炸和氯化銨預(yù)浸漬結(jié)合起來的潛力。需要對預(yù)處理后氮含量、半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的成分變化進(jìn)行測定。同時還需要根據(jù)預(yù)處理后酶水解和乙醇產(chǎn)量的效果對預(yù)處理的有效性進(jìn)行評價(jià)。2材料及其方法原材料由中國四川省成都的農(nóng)村地區(qū)收集到的水稻秸稈(Oryzasativa)。每份稻草由手工切制成15厘米大小，用濕布清潔上面灰塵，然后常溫下風(fēng)干。選擇的纖維素酶是里氏木霉YG3,平均濾紙酶活可達(dá)到50-60FPU/ml。在研究中所用分析純度試劑均購買來自于中國北京化學(xué)試劑公司。氯化銨預(yù)浸漬處理的蒸氣爆炸實(shí)驗(yàn)將干稻草用以1:1比例的水或氯化銨溶液(90克/升和135克/升)浸漬，并保證在室溫下靜置一夜。然后將預(yù)浸漬的稻草放入4.5升自主研制的蒸汽爆炸容器中(威海自動化有限公司，威海，中國)。在1.1或1.4MPa下進(jìn)行4分鐘的蒸汽爆炸，卸壓后可得到汽爆稻草(SERS)。另一組對照實(shí)驗(yàn)為干稻草預(yù)浸漬處理(以1:1的比率)，并保證在室溫下靜置一夜，不進(jìn)行蒸汽爆炸，將其作為未處理稻草(URS)。初步水解、同步糖化以及發(fā)酵URS和SERS直接用于同步糖化發(fā)酵試驗(yàn)而不進(jìn)行清洗。URS和SERS的初步水解發(fā)生在以醋酸鈉為緩沖液(lOOmM,pH值4.8),裝載20FPU/g纖維素酶作為底物的水浴搖床上，在50°C下緩慢攪拌36小時。初步水解后，待到溫度降低至137C。根據(jù)NH4C1(9G/100g底物)的相對含量用URS和SERS(未預(yù)浸漬的氣爆稻草)進(jìn)行填充再進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。在厭氧條件下用裝載有10%(v/v)酵母(釀酒酵母)接種溶液密封發(fā)酵36小時。酵母接種物的制備，將1克干酵母加入到50毫升含20克/升葡萄糖的無菌水中，讓其在37C下反應(yīng)1小時。為了檢測不同預(yù)處理方式的差異性，用SPSS對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。所有的結(jié)果的差異性很顯著的表示在PW0.05withnumberofreplicatesof2。2.4分析方法化學(xué)成分分析使用由Sluiter等人的標(biāo)準(zhǔn)NREL方法測定URS和SERS的化學(xué)組合物(Sluiteretal.,2008)。在30C下將樣品在72%H2SO4溶液中用水浴法處理60分鐘，然后通過加入蒸餾水將酸溶液稀釋到4%,在121C下高壓滅菌1小時。過濾分離出殘留物和水后將殘留物在105C下晾干一晚。然后將干燥的殘留物在550C下加熱3小時，并確定灰分含量。通過加熱前后殘留物灰分含量之差可計(jì)算出酸性不溶木質(zhì)素的含量。水解后濾液的主要結(jié)構(gòu)組分(葡聚糖、木聚糖和半乳聚糖)可在65C下用5mM的H2SO4配以0.5毫升/分鐘作為流動周期(Zhangetal.,2013)通過配備了折光率檢測器(G1362A)和AminexHPX-87H的HPLC高效液相層析儀(HPLC;Agilent1200,American)得出。樣品中酸性可溶木質(zhì)素是由紫外分光光度計(jì)測定。單糖的初步水解和乙醇的同步糖化發(fā)酵后的上清液濃度同樣是通過HPLC分析得出。纖維素轉(zhuǎn)化率計(jì)算如下：_amountoPglucose地]-'i；amtuninPGcJIntiiosc(g；■'i；9"Cd'uloseconvc^ion廣；「 ； IOCamtutritofcdIulose?0.9和0.95分別是葡聚糖和纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的換算系數(shù)。乙醇產(chǎn)率計(jì)算如下：Ethanolyield(%)=EtOH/[0.511x(f[biomass]x1.11)x100EtOHt是乙醇的重量，f是干燥生物質(zhì)含葡聚糖的分?jǐn)?shù)(克/克)，干燥生物質(zhì)是生物質(zhì)在發(fā)酵開始時的干重，0.511和1.11分別是葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇和葡聚糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的換算系數(shù)。測定氮含量和性質(zhì)將URS和SERS用10倍(V/W)的自來水洗滌三次，以確定氮含量的存在狀態(tài)。對洗滌后的樣品進(jìn)行風(fēng)干。用凱氏定氮法對樣品中總氮和不溶性氮含量進(jìn)行檢測(Jones,1991).取0.5克風(fēng)干樣品、3.5克硫酸鉀、0.4g硫酸銅和10mlH2SO4放入凱氏燒瓶中，反應(yīng)三小時。補(bǔ)水到100ml的總體積。硼酸混合物用作指示劑溶液，將消化后產(chǎn)物放入蒸餾裝置中。蒸餾后用鹽酸滴定法測定氮含量。可溶性氮含量的計(jì)算方法是用總氮減去不溶性氮的含量。潛在抑制劑的分析將5克預(yù)處理樣品在25毫升蒸餾水中浸泡3小時，然后以8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘?？啡┖土u甲基糠醛的濃度分別用配有UV檢測器(G1314B)的高效液相色譜在久280處確定和EclipseXDB-C18柱在30°C用甲醇、水、乙酸混合溶液(40:59.4:0.6,v/v/v)作為流動相在0.6mL/min處確定(Xiaoetal.,2011).。甲酸和醋酸的濃度在65C下用配備了折射率檢測器(G1362A)和AminexHPX-87H柱的HPLC用5mMH2SO4作為流動相0.5ml/min處測定。在同一時間，5克預(yù)處理樣品在105C下干燥4小時，然后稱重。抑制劑含量表示為ng/g的干燥樣本。3.結(jié)果與討論未處理稻草和氣爆稻草中氮含量及其性質(zhì)氯化銨預(yù)浸漬蒸汽爆破實(shí)驗(yàn)將會改變稻草中的C/N比。如表一中所示，在蒸汽爆炸之前用氯化銨溶液預(yù)浸漬，可以顯著提高稻草中可溶性和不溶性氮中的含量。SERS的氮含量會隨氯化銨用量增加而增加。在1.4MPa條件下用135g/l氯化銨溶液預(yù)浸漬，能得到4.14%的最高總氮含量，這樣比URS的效果高出2.86倍。結(jié)果顯示，該預(yù)處理方式使超過80%的氯化銨流入了稻草中，1.4MPa條件下178°C是極其重要的條件，這低于氯化銨的分解溫度(330°C),所以在該過程中幾乎不損失氮，流入稻草中的氮存在兩種狀態(tài)：水溶性氮源和非水溶性氮源(Canequeetal.,1998).進(jìn)行洗滌可溶性氮似乎更容易擴(kuò)散出來，這種方法可以用于無機(jī)氮源。不溶性氮也會被提高到1.48%，這比URS高出0.59倍。不溶性氮據(jù)推測通過一個不明的芳香胺的成分與SERS連接。較高的預(yù)處理溫度下與銨反應(yīng)，可以從半纖維素和木質(zhì)素中獲得更多的降解產(chǎn)物(Gotoetal.,1993).不溶性氮可以用于有機(jī)氮源，在同步糖化發(fā)酵過程中釋放。因此，銨可以轉(zhuǎn)化成不同類型的氮資源，并且它可以在乙醇發(fā)酵過程中被釀酒酵母利用。未處理稻草和氣爆稻草的酶解未處理稻草和氣爆稻草的酶解與NH4C1溶液預(yù)浸漬蒸汽爆破后，URS和SERS隨后酶水解36小時。葡萄糖產(chǎn)率如圖1所示。從URS中獲得的葡萄糖只有20.11%。SERS可以釋放出比URS更多的葡萄糖，葡萄糖含量范圍在46.09％至62.64％之間。1.4兆帕下蒸汽爆破用90克/升氯化銨預(yù)浸漬的預(yù)處理樣品，其最大葡萄糖產(chǎn)量為62.64%，whichwas2.1相較于1.4兆帕蒸汽爆炸URS預(yù)處理樣品的高出0.2倍。SERS與URS(1.4兆帕蒸汽爆炸帶/不帶90克/升氯化銨預(yù)浸漬)的酶解效率比較有顯著(P<0.05)的提高。結(jié)果表明，通過蒸汽爆炸預(yù)處理可提高纖維素的酶水解，而且可以通過氯化銨預(yù)浸漬使預(yù)處理的效果得到增強(qiáng)。未處理稻草和氣爆稻草的宏觀物理結(jié)構(gòu)預(yù)處理會是樣本的體積縮小，這是因?yàn)槠茐牧说静莸膭傂越Y(jié)構(gòu)。預(yù)處理后纖維會稍稍凝聚起來，但用手很容易將它們分離開來。預(yù)處理過后的纖維表面是粗糙、多孔、不規(guī)則的。在之前也有研究獲得相同的結(jié)論(Kim&Kim,2012).氯化銨預(yù)浸漬后爆破的稻草經(jīng)干燥后明顯成暗色.顏色的變化可能與其木質(zhì)素的化學(xué)分級有關(guān)。木質(zhì)素在降解過程中會融化、分解，并在氣爆后沉積在稻草表面(Liuetal.,2013).預(yù)處理過程中纖維的物理或化學(xué)變化使樣本的表面積增大，這能夠使它們與酶更好的反應(yīng)。3.2.3未處理稻草和氣爆稻草的化學(xué)成分作為植物細(xì)胞壁主要成分之一的半纖維素因?yàn)槁?lián)立纖維素和木質(zhì)素阻礙了木質(zhì)纖維素的酶水解。通過暴露纖維素晶體結(jié)構(gòu)的方式促進(jìn)底物和水解酶接觸，以達(dá)到降低半纖維素含量的預(yù)期效果。預(yù)處理氣爆后的稻草化學(xué)組成成分如表2所示。SERS中的半纖維素含量變化范圍為4.53%到8.14%,均低于URS(26.5%).化學(xué)成分的變化證明物質(zhì)的減少主要是半纖維素的減少。用135g/lNH4C1預(yù)浸漬在1.4MPa蒸汽爆破下半纖維素的去除率可達(dá)最高的86.66%半纖維素的減少可將原因歸于蒸汽爆破和NH4Cl預(yù)浸漬的協(xié)調(diào)作用。蒸汽爆破前在弱酸性條件下稻草預(yù)浸漬可最大限度的轉(zhuǎn)化木糖并增強(qiáng)蒸汽爆破破壞稻草結(jié)構(gòu)(Chenetal.,2011).在氣爆過程中，半纖維素與纖維素、木質(zhì)素的糖苷鍵會在一定程度上自動水解從而釋放壓力。這使得半纖維素在熱水中部分降解融化(Chen&Liu,2007).糖醛酸與木聚糖的酯鍵氨解后產(chǎn)生的氨離子可通過切割半纖維素與木質(zhì)素的連接鍵與木質(zhì)纖維素發(fā)生反應(yīng)(Wangetal.,1967).先前也有研究表明，氨甲基纖維素復(fù)合物的形成會使纖維素結(jié)晶度減少并提高纖維素的敏感度(Goto&Yokoe,1996).伴隨著半纖維素的降解，纖維素的含量明顯的從36.46%提高到50.2%。酶水解過程中纖維素的保留使糖含量得到提升。有趣的是，在預(yù)處理稻草中酸溶木質(zhì)素含量似乎比URS低，這表明預(yù)處理后部分木質(zhì)素發(fā)生了化學(xué)變化。這可能是因?yàn)闊嵴羝姑焰I斷裂從而使一些酸溶性木質(zhì)素從細(xì)胞壁被釋放出來(Wang,etal.,2012).然而，我們可以從SERS中檢測到非酸溶性木質(zhì)素增加了，這是由于半纖維素的降解和水萃取(Liuetal.,2013).通常，用氯化銨預(yù)浸漬蒸汽爆破是一種有效去除半纖維素、木質(zhì)素，并破壞纖維素晶體結(jié)構(gòu)的預(yù)處理方式。3.3未處理稻草和氣爆稻草的乙醇發(fā)酵3.3.1未處理稻草和氣爆稻草的乙醇產(chǎn)量顯然新穎的預(yù)處理方式會導(dǎo)致更多的乙醇產(chǎn)出。由于URS酶水解產(chǎn)生的葡萄糖濃度很低導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量只有16.22%。但是，乙醇產(chǎn)量并不與葡萄糖濃度成一致關(guān)系。在1.1MPa壓強(qiáng)下與135g/lNH4C1預(yù)浸漬可以得到最高的乙醇產(chǎn)量47.59%，這高于URS1.93倍，高于只1.1MPa壓強(qiáng)下氣爆預(yù)處理樣品0.68倍(Fig.2).SERS(1.1MPa氣壓下蒸汽爆破參/不參135g/lNH4Cl預(yù)浸漬處理)的乙醇產(chǎn)量與URS相較有顯著提升(pW0.05).雖然SERS(1.1MPa氣壓下蒸汽爆破加NH4Cl預(yù)浸漬處理)的乙醇產(chǎn)量隨氮源含量的增加而增加，但90g/l與135g/l氯化銨差異不大。需要指出的是SERS(1.1MPa氣壓下蒸汽爆破90g/lNH4Cl預(yù)浸漬樣本)中的氮源含量足夠釀酒酵母生長。較高的壓強(qiáng)下蒸汽爆破并不能顯著提高乙醇產(chǎn)量。這可能是因?yàn)樵谡羝七^程中產(chǎn)生了抑制劑。以前的研究表明在高濃度的糠醛、5-羥甲基糠醛或乙酸中釀酒酵母的發(fā)酵能力較差(Alviraetal.,2010).經(jīng)常會在蒸汽爆破過程中產(chǎn)生多種潛在抑制劑。抑制劑的動力學(xué)研究表明抑制劑的形成隨處理壓強(qiáng)和時間的增加而增加(Zhangetal.,2013),因此在1.4MPa氣壓下比1.1MPa.壓強(qiáng)下蒸汽爆破能產(chǎn)生更多的潛在抑制劑。雖然在1.4MPa氣壓下蒸汽爆破能產(chǎn)生更多的葡萄糖，但釀酒酵母的發(fā)酵能力會受到抑制劑的阻礙。3.3.2未處理稻草和氣爆稻草中潛在抑制劑的形成蒸汽爆破預(yù)處理是一個可溶性成分高溫化學(xué)反應(yīng)后接水解反應(yīng)的混合反應(yīng)過程。半纖維素與木質(zhì)素被溶解在液體中?？啡┦俏焯堑拿撍a(chǎn)物而5-羥甲基糠醛是己糖的脫水產(chǎn)物?？啡┖?-羥甲基混合降解產(chǎn)生甲酸。半纖維素中的乙酰基產(chǎn)生乙酸(Zhangetal.,2013).這些呋喃衍生物和弱酸似乎對酶活性和乙醇生產(chǎn)具有極強(qiáng)的抑制作用。更主要的是，這些化合物存在的負(fù)交互作用可能會加劇抑制作用(Barakatetal.,2012).表3總結(jié)了SERS中所包含的弱酸和咲喃衍生物。通常情況下，甲酸和乙酸與低的預(yù)處理溫度可以阻礙抑制劑的形成。這個猜測可以解釋乙醇產(chǎn)量和葡萄糖產(chǎn)量之間不一致的問題。過去的研究表明在蒸汽爆破前用稀酸預(yù)浸漬會導(dǎo)致產(chǎn)生大量的抑制劑(Martinetal.,2002.).在本研究中相比于單一蒸汽爆破，用氯化銨預(yù)浸漬處理后蒸汽爆破產(chǎn)生的抑制劑沒有顯著上升。3.4氯化銨預(yù)浸漬爆破與其他相關(guān)預(yù)處理方法的比較圖表對比了稀酸蒸汽爆破預(yù)處理(SE-H2SO4)(Vargaetal.,2004),蒸汽爆破預(yù)處理(SE)(Garcia-Aparicioetal.,2007),氨纖維爆破(AFEX)(Alizadehetal.,2005),氨水預(yù)處理(AA)(Salvietal.,2010),熱水預(yù)處理(LHW)(Kimetal.,2009)和稀酸預(yù)處理(DA)(Luetal.,2007)中的相關(guān)處理?xiàng)l件、氮含量、成分的降解和酶水解(Table4).氨纖維爆炸和氨水預(yù)處理是最常用的氨化處理。氨纖維爆炸能提高碳水化合物(纖維素和半纖維素)轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖和提高預(yù)處理樣本的氮含量(Urribarrfetal.,2005).雖然氨纖維爆炸只產(chǎn)生固體材料，而小的半纖維素和木質(zhì)素能夠被除去。但是氨的回收和再循環(huán)是個復(fù)雜且高成本的過程。氨水預(yù)處理可提高氮含量，但由于具有高發(fā)揮性和刺激性氣味，使用率相對較低(Salvietal.,2010).熱水預(yù)處理是一個綠色的預(yù)處理過程，無化學(xué)添加劑，但能源和水消耗很大。蒸汽爆破和稀酸預(yù)處理的一個巨大優(yōu)勢在于去除半纖維素上(超過70%).但是，這些預(yù)處理后的混合產(chǎn)物氮含量較低。用氯化銨預(yù)浸漬后蒸汽爆破處理是一個提高氮含量和增強(qiáng)酶水解的耦合過程。新穎預(yù)處理方式具有處理周期短、幾乎不損耗氯化銨、不添加腐蝕性或刺激性化學(xué)藥劑和高葡萄糖產(chǎn)量等優(yōu)勢。同步糖化發(fā)酵的主要問題在于酶促糖化和發(fā)酵的最佳溫度不同。這項(xiàng)研究表明在預(yù)水解階段將溫度維持在50°C以下可以提高水解速率，但隨后的同步糖化發(fā)酵需在適宜的溫度(37°C).酶消化率受酶活性、酶用量和反應(yīng)時間等的影響，我們初步研究表明最佳乙醇發(fā)酵在酶量為20FPU/g下預(yù)水解反應(yīng)36小時(Chen&Li,2013).因此，這被視為酶水解和乙醇生產(chǎn)的適宜條件(Chen&Li,2013).本實(shí)驗(yàn)方法的乙醇產(chǎn)量相較于不額外添加外部有機(jī)氮源的其他方法較低，但用氯化銨預(yù)浸漬后蒸汽爆破相較于單一蒸汽爆破得到的乙醇產(chǎn)量顯著提升。有人指出，在引入氨可以部分替代酒精發(fā)酵中的有機(jī)氮源。因此，新的預(yù)處理方法值得進(jìn)一步研究。結(jié)論本研究結(jié)果表明通過氯化銨預(yù)浸漬蒸汽爆破處理后氮源含量得到增加，通過半纖維素的降解和纖維素與木質(zhì)素的改良提高了酶解效果。由于較低的蒸汽爆破壓強(qiáng)減少了抑制劑的生成。因此，乙醇發(fā)酵效果得到加強(qiáng)。新穎預(yù)處理方式具有處理?xiàng)l件溫和、不污染環(huán)境、高葡萄糖產(chǎn)量和多種增氮方式等優(yōu)勢，因此該方面是值得研究的，并建議進(jìn)一步進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用。附錄A.補(bǔ)充數(shù)據(jù)致謝ThisresearchreceivedfinancialsupportfromtheNationalBasicResearchProgramofChina(973Project,No.2011CB707401),theNationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgramofChina(863Program,SS2012AA022502),andtheBeijingKeyLaboratoryProgramofCultivationandDevelopmentEngineeringofscienceandtechnologyinnovationbase(Z13111000280000).參考文獻(xiàn)[1]Alizadeh,H.,Teymouri,F.,Gilbert,T.I.,Dale,B.E.,2005.Pretreatmentofswitchgrassbyammoniafiberexplosion(AFEX).Appl.Biochem.Biotechnol.124,1133—1141.Alvira,P.,Tomas-Pejo,E.,Ballesteros,M.,Negro,M.,2010.Pretreatmenttechnologiesforanefficientbioethanolproductionprocessbasedonenzymatichydrolysis:areview.Bioresour.Technol.101,4851-4861.Barton,F.E.,Wolsink,J.H.,Vedder,H.M.,1986.Nearinfraredreflectancespectroscopyofuntreatedandammoniatedbarleystraw.Anim.Feed.Sci.Tech.15,189-196.Barakat,A.,Monlau,F.,Steyer,J.P.,Carrere,H.,2012.Effectoflignin-derivedandfurancompoundsfoundinlignocellulosichydrolysatesonbiomethaneproduction.Bioresour.Technol.104,90-99.Caneque,V.,Velasco,S.,Sancha,J.,Manzanares,C.,Souza,O.,1998.Effectofmoistureandtemperatureonthedegradabilityoffiberandonnitrogenfractionsinbarleystrawtreatedwithurea.Anim.FeedSci.Tech.74,241-258.Casey,G.P.,Ingledew,W.M.,1986.Ethanoltoleranceinyeasts.CRCCrit.Rev.Biotechnol.13,219-280.Chen,H.Z.,Li,G.H.,2013.Anindustriallevelsystemwithnonisothermalsimultaneoussolidstatesaccharification,fermentationandseparationforethanolproduction.Biochem.Eng.J.74,121-126.Chen,H.Z,Liu,L.Y.,2007.Unpollutedfractionationofwheatstrawbysteamexplosionandethanolextraction.Bioresour.Technol.98,666-676.Chen,W.H.,Pen,B.L.,Yu,C.T.,Hwang,W.S.,2011.Pretreatmentefficiencyandstructuralcharacterizationofricestrawbyanintegratedprocessofdilute-acidandsteamexplosionforbioethanolproduction.Bioresour.Technol.102,2912-2924.Garcia-Aparicio,M.P.,Ballesteros,M.,Manzanares,P.,Ballesteros,I.,Gonzalez,A.,Negro,M.J.,2007.Xylanasecontributiontotheefficiencyofcelluloseenzymatichydrolysisofbarleystraw.Appl.Biochem.Biotechnol.137,353-365.Goto,M.,Yokoe,Y.,1996.Ammoniationofbarleystraw.Effectoncellulosecrystallinityandwater-holdingcapacity.Anim.FeedSci.Tech.58,239-247.Goto,M.,Yokoe,Y.,Takabe,K.,Nisikawa,S.,Morita,O.,1993.Effectsofgaseousammoniaonchemicalandstructuralfeaturesofcellwallsinspringbarleystraw.Anim.FeedSci.Tech.40,207—221.Jeoh,T.,Ishizawa,C.I.,Davis,M.F.,Himmel,M.E.,Adney,W.S.,Johnson,D.K.,Cellulasedigestibilityofpretreatedbiomassislimitedbycelluloseaccessibility.Biotechnol.Bioeng.98,112-122.Jones,J.B.,1991.KjeldahlMethodforNitrogen(N)Determination.Micro-MacroPublishing,Athens.Kim,S.,Kim,C.H.,2012.Bioethanolproductionusingthesequentialacid/alkali-pretreatedemptypalmfruitbunchfiber.Renew.Energ.54,150-155.Kim,Y.,Mosier,N.S.,Ladisch,M.R.,2009.Enzymaticdigestionofliquidhotwaterpretreatedhybridpoplar.Biotechnol.Progr.25,340-348.Lau,M.W.,Dale,B.E.,Balan,V.,2008.Ethanolicfermentationofhydrolysatesfromammoniafiberexpansion(AFEX)treatedcornstoveranddistillersgrainwithoutdetoxificationandexternalnutrientsupplementation.Biotechnol.Bioeng.99,529-539.Limayem,A.,Ricke,S.C.,2012.Lignocellulosicbiomassforbioethanolproduction:currentperspectives,potentialissuesandfutureprospects.ProgEnergCombust,38,449-467.Liu,Z.H.,Qin,L.,Jin,M.J.,Pang,F.,Li,B.Z.,Kang,Y.,Dale,B.E.,Yuan,Y.J.,2013.Evaluationofstoragemethodsfortheconversionofcornstoverbiomasstosugarsbasedonsteamexplosionpretreatment.Bioresour.Technol.132,5-15.Lu,X.,Zhang,Y.,Yang,J.,Liang,Y.,2007.Enzymatichydrolysisofcornstoverafterpretreatmentwithdilutesulfuricacid.Chem.Eng.Technol.30,938-944.Martin,C.,Galbe,M.,Nilvebrant,N.O.,JonssonL.J.,2002.Comparisonofthefermentabilityofenzymatichydrolyzatesofsugarcanebagassepretreatedbysteamexplosionusingdifferentimpregnatingagents.Appl.Biochem.Biotech.98-100,699-716.Moriarty,P.,Honnery,D.,2012.Whatistheglobalpotentialforrenewableenergy?Renew.Sust.Energ.Rev.16,244-252.Salvi,D.,Aita,G.,Robert,D.,Bazan,V.,2010.Ethanolproductionfromsorghumbyadiluteammoniapretreatment.J.Ind.Microbiol.Biotechnol.37,27-34.Sarkar,N.,Ghosh,S.K.,Bannerjee,S.,Aikat,K.,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