基因工程制藥567節(jié)第1頁/共65頁一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因工程菌的質(zhì)粒不穩(wěn)定常見的是分裂不穩(wěn)定，它主要與兩個(gè)因素有關(guān)：⑴含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率；⑵這兩種菌的比生長速率差異的大小。

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對同一工程菌，控制不同的比生長速率可改變質(zhì)粒的拷貝數(shù)：低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高，增加工程菌中質(zhì)?？截悢?shù)可提高質(zhì)粒穩(wěn)定性；

第3頁/共65頁高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低，但大量外源質(zhì)粒的存在使含質(zhì)粒菌的比生長速率明顯降低，而一但不含質(zhì)粒菌產(chǎn)生，便成為優(yōu)勢菌株，對質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利。第4頁/共65頁

菌體生長速率對質(zhì)?？截悢?shù)和質(zhì)粒穩(wěn)定性有一影響。高比生長速率時(shí)質(zhì)?？截悢?shù)下降，但穩(wěn)定性增加。生長速率/h0.20.4質(zhì)粒拷貝數(shù)10.5×10950400β-半乳糖苷酶工程菌JM103(pUC8)的連續(xù)養(yǎng)3第5頁/共65頁Betenbaugh將質(zhì)粒復(fù)制必需的RepA蛋白克隆在PR啟動(dòng)子的下游，質(zhì)?？截悢?shù)受溫度誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后質(zhì)粒濃度從60μg／g細(xì)胞增加到l,900μg／g細(xì)胞，從而增加了基因拷貝數(shù)，使外源基因的表達(dá)明顯增加。第6頁/共65頁但是在高拷貝質(zhì)粒菌中質(zhì)?？截悢?shù)增加與產(chǎn)物增加往往不成正比，這可能是由于含高拷貝質(zhì)粒的菌中，蛋白合成的限速步驟是轉(zhuǎn)錄和翻譯，基因的大量復(fù)制加重了轉(zhuǎn)錄和翻譯的負(fù)擔(dān)，使其速度減慢。第7頁/共65頁質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析樣品不含抗性標(biāo)記抗生素

平板培養(yǎng)基10-12h100個(gè)菌落含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基

10-12h統(tǒng)計(jì)生長菌落數(shù)重復(fù)三次,計(jì)算比值,該比值反應(yīng)了質(zhì)粒的穩(wěn)定性

(穩(wěn)定性stability，ST)稀釋第8頁/共65頁二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法

為了提高質(zhì)粒穩(wěn)定性，工程菌培養(yǎng)采用兩階段培養(yǎng)法（分階段控制培養(yǎng)）：⑴先使菌體生長到一定密度；⑵再誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)選擇合適的宿主菌與合適的載體第9頁/共65頁在培養(yǎng)基中加入選擇性壓力（抗菌素）抑制質(zhì)粒丟失菌的生長，是提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的常用方法。

調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度可使工程菌生長速率具有優(yōu)勢。第10頁/共65頁

有些含質(zhì)粒菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢，間歇改變培養(yǎng)條件以改變兩種菌比生長速率，可改善質(zhì)粒穩(wěn)定性。通過間歇供氧和改變稀釋速率，都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。第11頁/共65頁例子：對表達(dá)干擾素αa的大揚(yáng)桿菌W3110(pEC901)在不同比生長速率下的質(zhì)粒穩(wěn)定性隨著稀釋率的增加，質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加，干擾素的比效價(jià)也明顯增大。第12頁/共65頁提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法？？選擇合適的宿主菌與載體增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)分兩階段培養(yǎng)工程菌選擇壓力改變發(fā)酵條件改變細(xì)胞的稀釋速率改變培養(yǎng)方式（固定化培養(yǎng)）第13頁/共65頁第六節(jié)基因工程菌生長代謝的特點(diǎn)菌體的生長通常用比生長速率來表示。工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源、控制補(bǔ)料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長?？刂凭w的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性、減少代謝副產(chǎn)物的積累、提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義。第14頁/共65頁

大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長速度也反映了蛋白質(zhì)的合成速度。培養(yǎng)條件的改變（營養(yǎng)成分、dO2、補(bǔ)料或稀釋速率、溫度等），會(huì)改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng)，影響生物大分子的合成和菌體的生長。第15頁/共65頁一、菌體的生長與能量的關(guān)系碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分。碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量，當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí)，菌體會(huì)產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適當(dāng)提高pH，可減少乙酸的抑制作用第16頁/共65頁培養(yǎng)基中存在4g/L乙酸時(shí)菌體比生長速率與基因表達(dá)量的關(guān)系37.7%63.4%0.170.82rIL-2工程菌K802(pLY-4)無乙酸乙酸4g/L第17頁/共65頁Δ分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源、補(bǔ)料培養(yǎng)中控制補(bǔ)料速度、連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能在一定范圍內(nèi)控制菌體的生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它產(chǎn)生的抑制作用。第18頁/共65頁ΔHan等發(fā)現(xiàn)在基本培養(yǎng)基中加入甲硫氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生。甲硫氨酸提高了菌體的有氧代謝能力；而酵母提取物在提高比生長速率的同時(shí)，能使菌體減少對葡萄糖的攝取，從而減少乙酸的產(chǎn)生。第19頁/共65頁通過基因構(gòu)建解決Beiley報(bào)道，在大腸桿菌中克隆具有攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長速率，減少乙酸的產(chǎn)生。Bauer采用磷酸乙?；溉毕葜曜鳛樗拗骷?xì)胞，阻止了乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酸，提高蛋白的產(chǎn)量。第20頁/共65頁減少發(fā)酵過程中乙酸副產(chǎn)物的影響途徑？pH值發(fā)酵控制（碳源、控制無機(jī)磷的濃度、補(bǔ)料速度、稀釋速率、提高溶氧）培養(yǎng)基中添加物質(zhì)（甲硫氨酸和酵母提取物）基因工程（攜帶氧能力的VHB蛋白基因、使用磷酸乙?；溉毕葜辏└淖兣囵B(yǎng)方式-透析培養(yǎng)第21頁/共65頁二、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體比生長率提高，蛋白合成增加?；蚬こ叹|(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)，加劇了這些成分的不足，特別是工程菌誘導(dǎo)后，外源基因的大量表達(dá)，引起工程菌比生長速率降低，甚至生長停滯。第22頁/共65頁質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響：Birnbaun發(fā)現(xiàn)，中等拷貝質(zhì)粒（56拷貝）的工程菌中，一些酶與前體合成有關(guān)的酶的相對水平增加，這些酶的基因大多受終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。高拷貝質(zhì)粒的工程菌（240拷貝）中，菌體比生長速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用，引起前體不足，從而產(chǎn)生“嚴(yán)緊反應(yīng)”有關(guān)。第23頁/共65頁

“嚴(yán)緊反應(yīng)”是當(dāng)氨酰tRNA不足時(shí),核糖體在密碼子上停留,并合成被稱為“魔點(diǎn)”的ppGpp的結(jié)果。

ppGpp是一個(gè)重要的調(diào)控分子。它通過影響RNA鏈的延伸過程減少轉(zhuǎn)錄。第24頁/共65頁

它的濃度增加會(huì)導(dǎo)致在合成mRNA和rRNA時(shí)RNA聚合酶在模板上的移動(dòng)產(chǎn)生停頓，RNA鏈延長速度減慢，使游離的RNA聚合酶濃度降低，嚴(yán)緊控制的啟動(dòng)子如rrnA等的轉(zhuǎn)錄減少。也可能ppGpp是通過干擾RNA聚合酶與PL啟動(dòng)子專一識(shí)別反應(yīng)來減少轉(zhuǎn)錄。第25頁/共65頁第七節(jié)基因工程菌發(fā)酵基因工程菌的培養(yǎng)過程包括:

⑴搖瓶操作了解基因工程菌生長的基礎(chǔ)條件,如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分、碳氮比，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對受體細(xì)胞的影響;

⑵培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制方案以及順序。第26頁/共65頁菌種一級種子搖瓶二級種子罐培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)

原料發(fā)酵培養(yǎng)滅菌發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物分離基配制

微生物發(fā)酵流程圖第27頁/共65頁基因工程藥物生產(chǎn)過程上游構(gòu)建（基因工程）發(fā)酵生產(chǎn)（發(fā)酵工程）純化制備

第28頁/共65頁5.5L發(fā)酵罐30L發(fā)酵罐第29頁/共65頁一、基因工程菌的培養(yǎng)方式基因工程菌的培養(yǎng)方式：1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)2、連續(xù)培養(yǎng)3、透析培養(yǎng)4、固定化培養(yǎng)第30頁/共65頁1、補(bǔ)料分批培養(yǎng)

補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)過一段時(shí)間后間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長的培養(yǎng)方法。溶氧控制、流加補(bǔ)料第31頁/共65頁2、連續(xù)培養(yǎng)將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至一定菌體濃度后，開動(dòng)進(jìn)料和出料的蠕動(dòng)泵，以控制一定的稀釋率進(jìn)行不間斷的培養(yǎng)。第32頁/共65頁3、透析培養(yǎng)利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響。

傳統(tǒng)生產(chǎn)外源蛋白的發(fā)酵方法，由于乙酸等代謝副產(chǎn)物的過高積累而限制工程菌的生長及外源基因的表達(dá)，而透析培養(yǎng)解決了上述問題。第33頁/共65頁4、固定化培養(yǎng)有利于提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性，便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對于分泌型菌更為有利。第34頁/共65頁二、基因工程菌的發(fā)酵工藝

基因工程菌的發(fā)酵與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵不同,基因工程菌帶外源基因,發(fā)酵的目的是使外源基因高效表達(dá)。它不僅涉及宿主載體和克隆基因之間的相互關(guān)系還和環(huán)境有關(guān)。第35頁/共65頁工藝要求：外源基因既高效表達(dá)，又有利于產(chǎn)品分離純化。第36頁/共65頁影響發(fā)酵的主要因素：⒈培養(yǎng)基成分的影響⒉接種量的影響⒊溫度的影響⒋溶解氧的影響⒌誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響⒍pH的影響第37頁/共65頁⒈培養(yǎng)基的影響

培養(yǎng)基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保持工程菌的穩(wěn)定性，使外源基因高效表達(dá)。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米漿、氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等。還有無機(jī)鹽、微量元素、維生素、生物素等。對營養(yǎng)缺陷型菌株還要補(bǔ)加相應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì)。第38頁/共65頁

不同的碳源對菌體的生長和外源基因表達(dá)有較大的影響。使用葡萄糖和甘油對菌體比生長速率及呼吸強(qiáng)度相差不大。但以甘油為碳源的菌體收獲量較大，而以葡萄糖為碳源的菌體產(chǎn)生的副產(chǎn)品較多。葡萄糖對lac啟動(dòng)子有阻遏作用。使用乳糖為碳源較為有利，乳糖對lac啟動(dòng)子起誘導(dǎo)作用。第39頁/共65頁在氮源中，酪蛋白水解物有利于產(chǎn)物的合成與分泌。色氨酸對trp啟動(dòng)子控制的基因有影響。無機(jī)磷在許多代謝反應(yīng)中是一個(gè)效應(yīng)因子，磷濃度不同，影響菌體生長。第40頁/共65頁在生物大分子(DNA、RNA、蛋白質(zhì))的合成、糖代謝、細(xì)胞呼吸及ATP濃度的控制中，過量的無機(jī)磷會(huì)刺激葡萄糖的利用、菌體生長和氧消耗。研究表明，在低磷濃度下，盡管最大菌體濃度較低，但產(chǎn)物產(chǎn)率及產(chǎn)物濃度都最高。第41頁/共65頁啟動(dòng)子只有在低磷酸鹽時(shí)才被啟動(dòng)，因此必須控制磷酸鹽的濃度，使細(xì)菌生長到一定密度，磷酸鹽被消耗至低濃度時(shí)，目的蛋白才被表達(dá)。起始磷酸鹽濃度應(yīng)控制在0.015mol／L左右，濃度低影響細(xì)菌生長，濃度高則外源基因不表達(dá)。第42頁/共65頁⒉接種量的影響

接種量是指移入的種子液體積和培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期。接種量小，菌體延遲期較長，使菌齡老化，不利于外源基因表達(dá)。第43頁/共65頁

接種量大，可縮短生長延遲期，菌體迅速繁衍，很快進(jìn)入對數(shù)生長期，適于表達(dá)外源基因。接種量過高，使菌體生長過快，代謝物積累過多，反而會(huì)抑制后期菌體的生長。

5%、10%、15%？？？？第44頁/共65頁⒊溫度的影響

溫度對基因表達(dá)的調(diào)控作用可發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或小分子調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成等水平上。

溫度對發(fā)酵過程的影響是多方面的。它影響各種酶的反應(yīng)速度，改變菌體代謝產(chǎn)物的反應(yīng)方向，影響代謝調(diào)控機(jī)制。第45頁/共65頁如大腸桿菌合成青霉素?；覆粌H受苯乙酸誘導(dǎo)和葡萄糖阻遏，而且還受溫度的調(diào)控。青霉素?；富蚬こ叹?大腸桿菌A56(pPA22)，合成青霉素?；傅牧繌?7℃起隨著溫度降低而逐漸增加，至20-22℃達(dá)到高峰，在18℃和16℃合成酶量又逐漸下降，這是由于在18℃和16℃培養(yǎng)時(shí)菌體生長較慢，影響所合成酶的總量。第46頁/共65頁

適宜的發(fā)酵溫度是既適合菌體的生長，又適合代謝產(chǎn)物合成的溫度。高溫或低溫都會(huì)使發(fā)酵異常，影響終產(chǎn)物的形成并導(dǎo)致減產(chǎn)。溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成。第47頁/共65頁溫度高(37℃)時(shí)，由于細(xì)菌的熱體克(hot-skock)系統(tǒng)被激活，大量的蛋白酶被誘導(dǎo)，使表達(dá)產(chǎn)物降解。因此，表達(dá)量低于在30℃時(shí)發(fā)酵的產(chǎn)量。重組人生長激素在不同的溫度培養(yǎng)時(shí)，還影響產(chǎn)物的表達(dá)形式：30℃培養(yǎng)時(shí)是可溶的，在37℃培養(yǎng)時(shí)則形成包含體。第48頁/共65頁⒋溶解氧的影響

對于好氧發(fā)酵,溶解氧濃度是重要的參數(shù)。好氧微生物利用溶解于培養(yǎng)液中的氧氣進(jìn)行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，則能提高發(fā)酵產(chǎn)率。第49頁/共65頁

發(fā)酵時(shí)，隨dO2濃度的下降，細(xì)胞生長減慢，ST值下降，發(fā)酵后期下降幅度更大。外源基因的高效表達(dá)需要大量的能量，促進(jìn)細(xì)胞的呼吸作用，提高對氧的需求。維持較高的dO2值，才能提高工程菌的生長，利于外源蛋白產(chǎn)物的形成。第50頁/共65頁

采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法,

可改變培養(yǎng)過程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量。第51頁/共65頁⒌誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響

對于λPL啟動(dòng)子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的溫度敏感型突變株（clts857），在28～300C下培養(yǎng)時(shí)，該突變體能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)溫度升高42℃時(shí)，該阻遏蛋白失活，使啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，提高目的基因的轉(zhuǎn)錄翻譯效率。一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)。第52頁/共65頁

在對數(shù)生長期，細(xì)胞快速繁殖，直到細(xì)胞密度達(dá)到109個(gè)/mL(OD600為2.5)為止，這時(shí)菌體數(shù)目倍增，對營養(yǎng)和氧需求量急增，營養(yǎng)和氧成了菌群旺盛代謝的限制因素。第53頁/共65頁⒍pH的影響

pH對細(xì)胞的正常生長和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響，所以應(yīng)根據(jù)工程菌的生長和代謝情況，對pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。第54頁/共65頁

采取兩段培養(yǎng)工藝時(shí)，培養(yǎng)前期重點(diǎn)是優(yōu)化工程菌的生長條件，培養(yǎng)后期重點(diǎn)是優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)條件,細(xì)胞生長期的最佳pH在6.8～7.4左右，外源蛋白表達(dá)的最佳pH為6.0～6.5。第55頁/共65頁

總之,最佳化的工藝是獲得:

最快生產(chǎn)周期、最高產(chǎn)量、最好質(zhì)量、最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果、最佳速度和最低失敗率等指標(biāo)的保