基因工程原理章在釀酒酵母和其他真菌中的克隆第1頁/共37頁真菌克隆的優(yōu)勢原核生物缺乏許多真核細(xì)胞所共有的功能，而真菌細(xì)胞具有。真菌細(xì)胞往往比植物和動物細(xì)胞更容易生長、操作。真菌細(xì)胞生物化學(xué)與高等真核生物非常相似，存在很多高等真核生物的同源基因。2第2頁/共37頁3酵母的優(yōu)勢釀酒酵母是理想的基因操作的真核生物：

1)細(xì)胞結(jié)構(gòu),e.g.nuclei,mitochodria,associationofDNAwithhistones.2)蛋白修飾,e.g.glycolization,phosphorylation.3)核不均一RNA（hnRNA）第3頁/共37頁把DNA導(dǎo)入真菌轉(zhuǎn)化Cellsarefirstlytreatedwithenzymestopreparespheroplasts（原生質(zhì)球）.ThentheforeignDNAisintroducedintospheroplastswithehtyleneglycol（乙二醇）inthepresenceofCaCl2orbyelectroporation.2.接合

Someenterobacterial（腸細(xì)菌）plasmidscanfacilitatetheplasmidtransferfromE.colitoS.cerevisiae.4第4頁/共37頁導(dǎo)入真菌的DNA的命運(yùn)5ThreeformsoftransformedDNA.Homologousreplacement同源替換,Homologousinsertion同源插入,Randominsertion隨機(jī)插入第5頁/共37頁6第6頁/共37頁應(yīng)用于真菌的質(zhì)粒載體yeastepisomalplasmid(酵母附加質(zhì)粒,YEps)yeastreplicatingplasmids(酵母復(fù)制質(zhì)粒,YRps)yeastcentromereplasmids(酵母著絲粒質(zhì)粒,YCps)yeastartificialchromosomes(酵母人工染色體YAC)7第7頁/共37頁它們具共同的特性對于許多限制性內(nèi)切酶，它們都含有唯一的作用位點(diǎn)。都可以在大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制，且通常具有高拷貝數(shù)。都具有在酵母中容易進(jìn)行選擇的標(biāo)記，且這些標(biāo)記也可以在大腸桿菌中彌補(bǔ)相應(yīng)的突變。e.g.His3,Leu2,Trp1,andLys28第8頁/共37頁9酵母附加型質(zhì)粒第9頁/共37頁酵母復(fù)制型質(zhì)粒自復(fù)制序列(ars)：可以使大腸桿菌載體在酵母細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的序列染色體DNA片段自復(fù)制序列與著絲點(diǎn)區(qū)別：前者作為復(fù)制起始位點(diǎn)發(fā)揮作用，而后者參與染色體的分離。10第10頁/共37頁酵母著絲粒質(zhì)粒在結(jié)構(gòu)上，質(zhì)粒攜帶的著絲粒序列具有與酵母染色體著絲粒區(qū)域相同的特有結(jié)構(gòu)。在功能上，YCp表現(xiàn)出酵母染色體的3個(gè)特征：1.在沒有選擇壓力的情況下，它們在有絲分裂中具有穩(wěn)定性。2.它們在減數(shù)分裂少按照孟德爾定律分離。3.它們在宿主細(xì)胞以低拷貝數(shù)存在。11第11頁/共37頁酵母人工染色體酵母染色體的末端都具有稱為端粒(telo－mere)的特殊結(jié)構(gòu)，這些末端在常規(guī)的DNA復(fù)制機(jī)制少往往無法完成復(fù)制。把酵母端?？寺〉結(jié)Rp上，構(gòu)建出第—個(gè)可保持為線性分子的載體，從而模擬了染色體。這樣的載體稱為酵母人工染色體(YAp).12第12頁/共37頁13構(gòu)建包含大片段克隆DNA的酵母人工染色體第13頁/共37頁類似反轉(zhuǎn)錄病毒的載體1.Ty(酵母轉(zhuǎn)座子):可移動遺傳因子,30-40copies/genome,5.9kb.1)Structure:Centralregion---2ORFTerminalregion---334bprepeatscalleddelta2)delta:eachcontainsapromoterandsequencesfortransposingenzyme3)ORF1andORF2ORF1:homologoustotnpAwhichactsasatrans-actingfactorORF2:reverse-transcriptase14第14頁/共37頁Fig9.415第15頁/共37頁2.OverexpressionofORF1caninducevirus–likeparticles(VLPs)formationinyeastcells.16第16頁/共37頁17第17頁/共37頁克隆載體的選擇把基因克隆到酵母中有3個(gè)理由：1.酵母是很有希望的克隆宿主，可以用來對有商業(yè)價(jià)值的蛋白進(jìn)行過量生產(chǎn)。2.是可以克隆大片段DNA。3.YAC為克隆大片斷DNA提供了方便的途徑。18第18頁/共37頁19第19頁/共37頁20第20頁/共37頁在酵母中利用同源重組構(gòu)建質(zhì)粒1.UsuallyarecombinantmolecularcanbeobtainedbyligationoftwoDNAinvitro.2.

Thiscanbeachievedbyrecombinationinvivo,e.g.ToinserttheHis3frompBR328intoYep420.21第21頁/共37頁22第22頁/共37頁克隆基因的表達(dá)1.Typicalyeastpromoters’properties1)Initiator:TC(G/A)A,PuPuPyPuPu2)TATAbox3)Upstreamactivatingsequences(UASs)4)Upstreamrepressingsequences(URSs)23第23頁/共37頁24第24頁/共37頁2.Expressionofclonedcanalsobeaffectedbydownstreamactivatingsequences(DASs).

Phosphoglyceratekinase(磷酸甘油酸激酶，PGK)promotercanmakeheterologousproteinsaccumulateto1-2%oftotalcellprotein,whereasphosphoglyceratekinaseitselfaccumulatestoover50%..WhenDASsisaddedtodownstreamofPGKsequence,theexpressionlevelisrestored.25第25頁/共37頁蛋白在真菌中的過量表達(dá)1.Promoters:regulatede.g.GAL1Promoter:inducedbygalactoseinhibitedbyglucoseandactivatedbyGAL4protein.2.Hostcellse.g.巴斯德畢赤酵母

1)Astrongpromoter:AOX12)Integrateatspecificsites

3)

thestrainscanbecultivatedtohighdensity.26第26頁/共37頁27酵母中與半乳糖代謝相關(guān)的基因和酶第27頁/共37頁28酵母中半乳糖基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控第28頁/共37頁專用載體29用于酵母的特殊載體第29頁/共37頁30用于巴斯德畢赤酵母的特殊載體第30頁/共37頁YeastsurfacedisplayPrinciple:Thereexistsasurfacereceptorα-agglutinin(凝集素，Aga),whichisaglycoproteinconsistedoftwosubunitscalledAga1andAga2.Aga1iscovalentlyligatedtocellwallandbindstoAga2bytwo–S-S-.IfatargetproteinisfusedwiththeC-terminalofAga2,thentherecombinantproteinwillbedisplayedonthesurfaceofyeastcells.31第31頁/共37頁32第32頁/共37頁檢測蛋白—蛋白間的相互作用Principle:GAL4proteinhastwoseparatedomainsforbindingtoUASDNAandtranscriptionalactivation.TheDNAbindingdomain(DBD)isfusedtoatestprotein(bait誘餌),whiletheactivationdomain(prey獵物)isfusedwithaproteinencodedbylibraryplasmids.Ifthetestproteincaninteractwiththeproteinfromlibrary,thebaitandthepreybindtogether,andactivatethetranscriptionofareportgenesuchasLacZ.33第33頁/共37頁酵母雙雜交系統(tǒng)Fig9.1134第34頁/共37頁Fig