基因工程的主要技術(shù)原理第1頁/共53頁1、Southernblot雙鏈DNA限制性內(nèi)切酶消化電泳分離檢測放射自顯影轉(zhuǎn)膜NaOH變性洗膜雜交標記的探針NaOH或高溫變性原理和方法:五.分子雜交技術(shù)第2頁/共53頁應(yīng)用:

基因拷貝數(shù)檢測;基因文庫篩選,獲取目的基因;遺傳疾病診斷;轉(zhuǎn)基因樣品檢測,等…第3頁/共53頁2、Northernblot是相對于Southernblot而命名的。利用DNA-RNA鏈或RNA-RNA鏈雜交的原理，通過DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。原理和方法:第4頁/共53頁單鏈RNA變性膠電泳分離檢測放射自顯影轉(zhuǎn)膜洗膜雜交標記的探針NaOH或高溫變性第5頁/共53頁應(yīng)用:主要用于基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達研究。基因時空特異性表達，及表達模式分析；候選基因表達分析，有利于排除候選基因，等…第6頁/共53頁第7頁/共53頁Pi36-1Pi36-2RiceGAAS預(yù)測CRG2(2)CRG3(0)CRG4(0)5.8kb4.8kb6.4kbabc物理圖譜NBS-LRRNBS-LRRRM5647(5)第8頁/共53頁Northernblot的原理與Southernblot相比有三點不同:(1)檢測的對象不同.(2)變性方法是不同的,它不能用堿變性,因為堿變性會導(dǎo)致RNA的降解.(3)探針不同.第9頁/共53頁3、Westernblot通過抗體與靶蛋白的抗原特異性反應(yīng)檢測蛋白質(zhì)樣品。主要用于基因在蛋白質(zhì)水平上的表達研究。第10頁/共53頁Westernblot的原理與Southernblot相比有兩點不同:(1)檢測的對象不同.(2)探針的性質(zhì)不同,在Westernblot中使用的探針是抗體(蛋白質(zhì))第11頁/共53頁

將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細胞中保存和擴增。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫。一、基因文庫的構(gòu)建1.基因文庫（genelibrary）第五節(jié)基因文庫構(gòu)建第12頁/共53頁（2）目前常用的載體2.構(gòu)建基因文庫的載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。（1）對載體的要求載體系列：容量為24kpcosmid載體：容量為50kbYAC：容量為1MbBAC:容量為300kb第13頁/共53頁斷點完全隨機，片斷長度合適于載體連接。不能用一般的限制性內(nèi)切酶消化法。（1）染色體DNA大片段的制備3.基因文庫構(gòu)建的一般步驟超聲波（300bp）或機械攪拌（8kb）。①物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進行局部消化。可得到10-30kb的隨機片斷。②酶切法：第14頁/共53頁（2）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。②人工接頭法（adapter）人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。第15頁/共53頁各種酶的接頭可以向公司定做或購買。接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端③同聚物加尾第16頁/共53頁第17頁/共53頁4.基因組文庫的大小一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含了整個基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長度占整個基因組DNA的百分數(shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）第18頁/共53頁例如：人的基因組是3×109bp，插入DNA片斷的平均長度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大??；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×105第19頁/共53頁1.cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。2.cDNAlibrary二、cDNA文庫的構(gòu)建mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。第20頁/共53頁（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細菌中直接表達。（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建。4.構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟（1）總RNA（totalRNA）提取3.cDNA文庫的特點提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。第21頁/共53頁分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。（2）mRNA的分離純化①原理②mRNA的分離純化Column（柱）第22頁/共53頁第23頁/共53頁反轉(zhuǎn)錄酶（3）cDNA的合成①cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。用OligodT（或隨機引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物第24頁/共53頁用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’3’5’5’引物cDNA第一鏈3’5’引物②降解mRNA模板或RNaseH堿第25頁/共53頁剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’③cDNA第二鏈合成第26頁/共53頁④去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’第27頁/共53頁第28頁/共53頁這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。妙用RNaseH小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。DNAPolI除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。第29頁/共53頁mRNAcDNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligase去引物第30頁/共53頁第31頁/共53頁在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌?；蚪柚┒宿D(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。5.cDNA與載體連接：接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶第32頁/共53頁第33頁/共53頁6.cDNA文庫的大小一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）1n1n第34頁/共53頁第六節(jié)酵母雙雜交系統(tǒng)YeastTwoHybridSystem(Interactiontrap)90年代，紐約大學(xué)的S.Field等建立。第35頁/共53頁有效地分離能與一種已知的靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)二、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個在結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上也相互獨立的結(jié)構(gòu)域組成。1.結(jié)構(gòu)域（Domain）合作一、酵母雙雜交系統(tǒng)的作用第36頁/共53頁例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNAbindingdomainActivedomainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄機GAL4效應(yīng)基因結(jié)合結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄只要DNAbindingdomain（DNA-BD）與Activedomain（AD）靠近就能夠表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活活性。實驗發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)錄表達第37頁/共53頁2.拆開DomainDNAbindingdomainActivedomain上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄機GAL4效應(yīng)基因結(jié)合用重組DNA技術(shù)把GAL4的兩個Domain分開，就喪失了激活效應(yīng)基因的能力。不能轉(zhuǎn)錄第38頁/共53頁3.重組Domain用重組DNA技術(shù)把這兩個Domain分別與兩個不同的多肽連接。Activedomain蛋白A蛋白BDNAbindingdomain在體內(nèi)，蛋白A與蛋白B是否能結(jié)合。通過效應(yīng)基因是否被激活來檢查：4.觀察報告基因表達第39頁/共53頁上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄機GAL4效應(yīng)基因蛋白ADNAbindingdomain轉(zhuǎn)錄激活domain蛋白BGAL4的DBdomain與ADDomain也不能靠近，所以仍然不能啟動效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。不能轉(zhuǎn)錄（1）如果蛋白A與蛋白B不能相互結(jié)合第40頁/共53頁上游激活序列（UAS）轉(zhuǎn)錄機GAL4效應(yīng)基因蛋白ADNAbindingdomain轉(zhuǎn)錄激活domain蛋白B激活轉(zhuǎn)錄GAL4的DBdomain與ADDomain也能靠近，所以能啟動效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄表達（2）如果蛋白A與蛋白B能相互結(jié)合第41頁/共53頁雙雜交原理X基因和Y基因產(chǎn)物的相互結(jié)合，導(dǎo)致reportergene表達。Reportergene表達就可說明X基因產(chǎn)物與Y基因產(chǎn)物能結(jié)合。第42頁/共53頁三、構(gòu)建雙雜交體系的宿主菌

刪除基因組中的內(nèi)源野生型GAL4基因使酵母菌只能利用載體表達的GAL4蛋白。如：SFY526;HF7c等菌株。四、構(gòu)建報告基因（reportergene）GAL4激活組氨酸合成酶的表達，使酵母菌能生長在組氨酸缺乏培養(yǎng)基上。GAL4的效應(yīng)基因是his3/lacZ/URA3。此外還有其他營養(yǎng)缺陷。第43頁/共53頁1.穿梭質(zhì)粒（shuttleplasmid）五、構(gòu)建雙雜交體系的穿梭質(zhì)粒既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在酵母菌中復(fù)制和表達的質(zhì)粒。2.雙雜交體系需要兩種穿梭質(zhì)粒分別攜帶已知的靶蛋白基因和攜帶未知基因序列。第44頁/共53頁靶基因按正確的讀碼結(jié)構(gòu)和取向克隆在GAL4的BD之后。（1）BD-plasmidP:ADH1啟動子。T:ADH1終止子。篩選標志：TRP核定位信號是GAL4本身的一部分ADH：Alcoholdehydrogenase第45頁/共53頁（2）AD-plasmid外源基因按正確閱讀框克隆到GAL4的AD片斷之后。P:ADHI啟動子。T:ADHI終止子。篩選標志：LEU2核定位信號是SV40的T抗原的序列第46頁/共53頁六、酵母雙雜交的實驗過程1.把蛋白A插入到BD質(zhì)粒上（pGBT9）2.把蛋白B插入到AD質(zhì)粒上（pGAD424）3.兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母菌（HF7c