基因工程的基本步驟第1頁(yè)/共69頁(yè)

基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測(cè)與鑒定第2頁(yè)/共69頁(yè)基因:有遺傳效應(yīng)的DNA片段基因的分布,成分,結(jié)構(gòu),功能與DNA一致染色體基因思考：什么是基因?

基因與ＤＮＡ的關(guān)系基因與染色體的關(guān)系

回憶舊知識(shí)：基因的基本功能是什么？第3頁(yè)/共69頁(yè)1、通過(guò)復(fù)制，在后代的傳種接代中傳遞遺傳信息2、在后代的個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，使遺傳信息得以表達(dá)，控制生物的性狀

DNA（基因）的基本功能DNA中堿基對(duì)(或脫氧核苷酸)的排列順序第4頁(yè)/共69頁(yè)時(shí)間場(chǎng)所過(guò)程模板原料能量，酶產(chǎn)物特點(diǎn)有絲分裂間期或減數(shù)分裂間期主要在細(xì)胞核，少數(shù)在線(xiàn)粒體、葉綠體；原核細(xì)胞的擬核區(qū)DNA分子兩條單鏈（稱(chēng)為母鏈）四種游離的脫氧核苷酸ATP；DNA解旋酶、聚合酶等子代DNA分子(與親代一模一樣)邊解旋邊復(fù)制、半保留復(fù)制；

一.ＤＮＡ的復(fù)制解旋合成復(fù)旋有的是多起點(diǎn)復(fù)制第5頁(yè)/共69頁(yè)第6頁(yè)/共69頁(yè)轉(zhuǎn)錄：在細(xì)胞核內(nèi)，以DNA的一條鏈為模板，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則合成RNA的過(guò)程。（一）——轉(zhuǎn)錄二.基因的表達(dá):基因指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成

第7頁(yè)/共69頁(yè)TCATGTTTAAGT

AC

AA

A

T

DNA的平面結(jié)構(gòu)圖第8頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

AGCUGACGGUUUDNA單鏈游離的核糖核苷酸以DNA的一條鏈為模板合成RNA第9頁(yè)/共69頁(yè)

RNA聚合酶AG

T

AC

AA

A

T

AGCUGACGGUUU

DNA與RNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)：A—U；Ｇ—C；C—G；T—ADNA單鏈第10頁(yè)/共69頁(yè)AGT

AC

AA

A

T

AGCGACGGUUUU

組成

RNA的核糖核苷酸一個(gè)個(gè)連接起來(lái)DNA單鏈第11頁(yè)/共69頁(yè)AGT

AC

AA

A

T

AGCGACGGUUUU

組成

RNA的核糖核苷酸一個(gè)個(gè)連接起來(lái)DNA單鏈第12頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

GCGACGGUUUUA

組成

RNA的核糖核苷酸一個(gè)個(gè)連接起來(lái)DNA單鏈第13頁(yè)/共69頁(yè)AGT

AC

AA

A

T

GCGACGUUGUUA

組成

RNA的核糖核苷酸一個(gè)個(gè)連接起來(lái)DNA單鏈第14頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

GCGACGUGUUAU

組成

RNA的核糖核苷酸一個(gè)個(gè)連接起來(lái)DNA單鏈第15頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

GCGACGGUUAUU

組成

RNA的核糖核苷酸一個(gè)個(gè)連接起來(lái)DNA單鏈第16頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

GCGACGGUUAUUA

組成

RNA的核糖核苷酸一個(gè)個(gè)連接起來(lái)DNA單鏈第17頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

GCGCGGUUAUUAU

組成

RNA的核糖核苷酸一個(gè)個(gè)連接起來(lái)DNA單鏈第18頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

GGCGGUUAUUAUC

組成

RNA的核糖核苷酸一個(gè)個(gè)連接起來(lái)DNA單鏈第19頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

GGCGGUUAUUAUC結(jié)果:形成的

mRNA鏈上,具有了特定的堿基序列，即DNA上的遺傳信息傳遞到了mRNA上mRNADNA單鏈第20頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

細(xì)胞核

核孔DNAmRNA在細(xì)胞核中合成

細(xì)胞質(zhì)第21頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

細(xì)胞核DNAmRNA在細(xì)胞核中合成

細(xì)胞質(zhì)第22頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

細(xì)胞核DNAmRNA在細(xì)胞核中合成

細(xì)胞質(zhì)第23頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

細(xì)胞核DNAmRNA在細(xì)胞核中合成

細(xì)胞質(zhì)第24頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

細(xì)胞核DNAmRNA在細(xì)胞核中合成

細(xì)胞質(zhì)第25頁(yè)/共69頁(yè)AGT

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

細(xì)胞核DNAmRNA在細(xì)胞核中合成

細(xì)胞質(zhì)第26頁(yè)/共69頁(yè)AG

T

AC

AA

A

T

UCAUGAUUAmRNA

細(xì)胞質(zhì)

細(xì)胞核DNAmRNA在細(xì)胞核中合成第27頁(yè)/共69頁(yè)基因的表達(dá)（二）——翻譯密碼子mRNA上決定一個(gè)氨基酸的3個(gè)相鄰的堿基密碼子的位置密碼子的組成密碼子的作用mRNA上3個(gè)相鄰的堿基決定一個(gè)氨基酸mRNA怎樣控制蛋白質(zhì)的合成？mRNA的堿基序列()決定蛋白質(zhì)的氨基酸序列密碼子思考:第28頁(yè)/共69頁(yè)AUU氨基酸氨基酸氨基酸t(yī)RNA:轉(zhuǎn)運(yùn)RNA

可以專(zhuān)一地識(shí)別并搬運(yùn)一種氨基酸問(wèn)題：氨基酸是怎樣被運(yùn)送到核糖體的？氨基酸氨基酸氨基酸第29頁(yè)/共69頁(yè)AUAGGAGAAAGAUUAUUAUUmRNA問(wèn)題：氨基酸是怎樣被運(yùn)送到核糖體的？AUUAUUAUU密碼子和反密碼子之間按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,氨基酸正確排序密碼子反密碼子第30頁(yè)/共69頁(yè)AUUCCUAUAGGAGAUUGUUAUAAUAUUAUUCCUCCUmRNA核糖體第31頁(yè)/共69頁(yè)AUUCCUAUAGGAGAUUGUUAUAAUCCACCACCA第32頁(yè)/共69頁(yè)CCUAUAGGAGAUUGUUAUAAUCCAACAACAACA第33頁(yè)/共69頁(yè)AUAGGAGAUUGUUAUAAUCCAACAAUAAUAAUA第34頁(yè)/共69頁(yè)AUAGGAGAUUGUUAUAAUACAAUAUUAUUAUUA第35頁(yè)/共69頁(yè)AUAGGAGAUUGUUAUAAUAUAUUA第36頁(yè)/共69頁(yè)AUAGGAGAUUGUUAUAAUUUA第37頁(yè)/共69頁(yè)AUAGGAGAUUGUUAUAAU多肽第38頁(yè)/共69頁(yè)規(guī)律:決定蛋白質(zhì)中的一個(gè)氨基酸,需mRNA中____至少個(gè)堿基;需DNA中___至少個(gè)堿基.DNA(雙鏈):mRNA(單鏈):蛋白質(zhì):堿基氨基酸1個(gè)3個(gè)6個(gè)遺傳信息遺傳密碼AA序列堿基第39頁(yè)/共69頁(yè)外顯子內(nèi)含子與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)原核生物基因真核生物基因基因的結(jié)構(gòu)第40頁(yè)/共69頁(yè)啟動(dòng)子

起始密碼/終止子

/終止密碼存在分子：作用：DNA(基因)啟動(dòng)/終止轉(zhuǎn)錄mRNA起始/終止翻譯第41頁(yè)/共69頁(yè)1、人工合成2、從基因文庫(kù)中獲取(基因比較小，序列已知)基因文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)－－如：cDNA文庫(kù)目的基因的獲取DNA合成儀第42頁(yè)/共69頁(yè)2、從基因文庫(kù)中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)?；蛭膸?kù)

基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)(CDNA文庫(kù))第43頁(yè)/共69頁(yè)某生物體內(nèi)全部DNA許多DNA片段受體菌群體2、從基因文庫(kù)中獲取目的基因限制酶與運(yùn)載體連接導(dǎo)入基因組文庫(kù)某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運(yùn)載體連接導(dǎo)入部分基因文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）第44頁(yè)/共69頁(yè)?為什么cDNA文庫(kù)中不含啟動(dòng)子、內(nèi)含子？第45頁(yè)/共69頁(yè)從基因文庫(kù)獲取目的基因根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，如：基因的已知核苷酸序列；基因的功能；基因在染色體上的位置；基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA；基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)；

……第46頁(yè)/共69頁(yè)1、人工合成2、從基因文庫(kù)中獲取3、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增(基因比較小，序列已知)基因文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)－－如：cDNA文庫(kù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)目的基因的獲取DNA合成儀第47頁(yè)/共69頁(yè)3、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)?？梢垣@得大量的目的基因。第48頁(yè)/共69頁(yè)循環(huán)變性退火延伸第49頁(yè)/共69頁(yè)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制

PCR擴(kuò)增DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物溫度控制1）模板：2）原料：3）酶：DNA母鏈4種脫氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶等DNA增殖4）特點(diǎn):半保留復(fù)制邊解旋邊復(fù)制(不用DNA解旋酶)半保留復(fù)制全解旋再?gòu)?fù)制第50頁(yè)/共69頁(yè)復(fù)制原點(diǎn)+啟動(dòng)子+目的基因+終止子+標(biāo)志基因基因表達(dá)載體的組成基因表達(dá)載體的構(gòu)建---核心第51頁(yè)/共69頁(yè)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端第52頁(yè)/共69頁(yè)(一)常用的受體細(xì)胞：

有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。（二）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞---轉(zhuǎn)化第53頁(yè)/共69頁(yè)（三）導(dǎo)入方法1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法適用于雙子葉植物裸子植物將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞---轉(zhuǎn)化第54頁(yè)/共69頁(yè)適用于單子葉植物基因槍法第55頁(yè)/共69頁(yè)胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊第56頁(yè)/共69頁(yè)花粉管通道法適用于被子植物第57頁(yè)/共69頁(yè)種子植物裸子植物被子植物雙子葉植物單子葉植物:松、柏、杉…:花生、大豆、棉花…:水稻、小麥、玉米…雙子葉植物－網(wǎng)狀脈單子葉植物－平行脈第58頁(yè)/共69頁(yè)1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)提純基因表達(dá)載體體外顯微注射入受精卵受精卵移植（三）導(dǎo)入方法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞---轉(zhuǎn)化第59頁(yè)/共69頁(yè)1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞Ca2+處理增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性（三）導(dǎo)入方法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞---轉(zhuǎn)化第60頁(yè)/共69頁(yè)四.目的基因的檢測(cè)和鑒定接種實(shí)驗(yàn)(抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等)抗原－抗體雜交法DNA-RNA分子雜交法DNA分子雜交法受體是否具有轉(zhuǎn)基因特征個(gè)體水平目的基因是否翻譯目的基因是否轉(zhuǎn)錄目的基因是否導(dǎo)入分子水平方法檢測(cè)/鑒定對(duì)象第61頁(yè)/共69頁(yè)DNA分子雜交第62頁(yè)/共69頁(yè)基因探針，是一段帶有檢測(cè)標(biāo)記，且序列已知的，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列?；蛱结樛ㄟ^(guò)分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號(hào)，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來(lái)。第63頁(yè)/共69頁(yè)基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定1、化學(xué)方法人工合成2、從基因文庫(kù)中獲取目的基因3、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、Ca2+處理法DNA分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)、抗原—抗體雜交技術(shù)分子檢測(cè)外的個(gè)體水平鑒定第64頁(yè)/共69頁(yè)鞏固練習(xí):1.人們常選用的細(xì)菌質(zhì)粒分子往往帶有一個(gè)抗生素抗性基因,該抗性基因的主要作用是()A.提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B.有利于對(duì)目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測(cè)C.增加質(zhì)粒分子的分子量D.便于與外源基因連接2.在遺傳工程技術(shù)中,限制性?xún)?nèi)切酶主要用于()A.目的基因的提取和導(dǎo)入B.目的基因的提取和檢測(cè)C.目的基因與載體的結(jié)合和導(dǎo)入D.目的基因的提取與載體結(jié)合BD第65頁(yè)/共69頁(yè)3.在遺傳工程技術(shù)中,下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲得()A.人的胰島素基因