基因工程重組體克隆的篩選和鑒定第1頁/共91頁第七章

重組體克隆的篩選和鑒定第2頁/共91頁一、抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒上有兩個抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。

Tetr上有插入位點(diǎn)BamHI和SalI;Ampr上有插入位點(diǎn)PstI。第一節(jié)

載體表型選擇法1.原理：第3頁/共91頁pBR322第4頁/共91頁（1）四環(huán)素：（2）氨芐青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素標(biāo)記選擇產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。抑制細(xì)菌生長，但不殺死細(xì)菌。殺死生長的細(xì)菌，但不殺死停止生長的細(xì)菌。（3）環(huán)絲氨酸：第5頁/共91頁3.選擇過程：如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來；Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。（1）四環(huán)素抗性插入失活第6頁/共91頁無環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基第7頁/共91頁（2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。也可以用含青霉素的培養(yǎng)基直接篩選。青霉素分子不消耗碘，其降解產(chǎn)物青霉酮酸消耗碘，因此可根據(jù)碘的顯色反應(yīng)確定氨芐青霉素抗性基因是否失活。藍(lán)色碘沒有消耗青霉素沒降解陽性克隆第8頁/共91頁抗藥性標(biāo)記選擇應(yīng)注意的問題抗藥性標(biāo)記選擇如果用藥物直接篩選，觀察和確定轉(zhuǎn)化子菌落的培養(yǎng)時間不宜過長，以12－16小時為宜，否則會出現(xiàn)假陽性轉(zhuǎn)化子菌落。因?yàn)檗D(zhuǎn)化子菌落會降解選擇藥物，導(dǎo)致非陽性轉(zhuǎn)化子菌落周圍選擇藥物濃度降低。第9頁/共91頁二、-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)++深藍(lán)色1.原理：載體上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點(diǎn)。受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（

片段缺失）?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達(dá)。載體和受體菌基因組可以互補(bǔ)形成完整有功能的-半乳糖苷酶。第10頁/共91頁2.選擇過程第11頁/共91頁-半乳糖苷酶使Xgal分解成蘭色產(chǎn)物。第12頁/共91頁利用插入的外源基因的表達(dá)產(chǎn)物特性進(jìn)行直接選擇。（只在特定條件下）。轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受體菌株的突變型缺陷。一、原理：第二節(jié)

根據(jù)插入基因的表型選擇1.彌補(bǔ)缺陷his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長第13頁/共91頁小鼠的二輕葉酸還原酶（DHFR）對三甲氧芐二氨嘧啶有抗性。DHFR載體連接轉(zhuǎn)化受體菌三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板含DHFR的克隆才能生長例：使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。2.增加新性狀第14頁/共91頁利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。一、直接電泳檢測法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。第三節(jié)

DNA電泳檢測法

分子量Marker載體重組克隆第15頁/共91頁二、酶切電泳篩選法1.原理：根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長度）?；蛴煤线m的內(nèi)切酶切下插入片段，再用其它酶切這個片段，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計(jì)的結(jié)果。第16頁/共91頁ABA或B第17頁/共91頁第18頁/共91頁不同克隆的酶切結(jié)果第19頁/共91頁插入片段第20頁/共91頁三、PCR擴(kuò)增檢測法1.原理PCR能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期DNA片段。2.過程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片段引物作PCR。（3）電泳PCR產(chǎn)物。（4）檢查是否有PCR產(chǎn)物。（5）PCR產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致。第21頁/共91頁1.核酸雜交第四節(jié)

核酸雜交檢測法

一、原理：重組克隆與探針雜交。3.識別標(biāo)記32P或

125I。（1）放射性同位素2.檢測用的探針與外源DNA插入片段互補(bǔ)的序列。（2）非放射性標(biāo)記熒光素第22頁/共91頁二、核酸雜交檢測方法用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。1.Southernblotting從宿主細(xì)胞中提取DNA（或質(zhì)粒載體），再用探針雜交。只有帶有插入片段的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。第23頁/共91頁酶切前酶切后插入片段載體含插入片段插入片段探針雜交結(jié)果第24頁/共91頁Southernblot篩選結(jié)果第25頁/共91頁（1）原位雜交篩選特點(diǎn)：對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。第26頁/共91頁第27頁/共91頁（2）R-環(huán)檢測法DNA-RNA雜交。2）原理：3）選擇過程在70%甲酰胺中，把DNA雙鏈變性，復(fù)性的時候，DNA-RNA雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見R-環(huán)形結(jié)構(gòu)。用外源基因的mRNA與重組載體雜交。1）R-環(huán)：R-環(huán)：是指RNA通過取代與其序列一致的DNA鏈而與雙鏈DNA雜交，被取代的DNA單鏈與RNA-DNA雜交雙鏈所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。第28頁/共91頁缺點(diǎn)：需要電鏡！第29頁/共91頁2.Northernblotting用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。主要檢測插入片段是否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交。第30頁/共91頁利用抗體作為“探針”來檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：一、放射性抗體檢測法第五節(jié)

免疫化學(xué)檢測法

1.抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式對表達(dá)產(chǎn)物的檢測。蛋白——蛋白“雜交”

第31頁/共91頁待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗125I標(biāo)記的二抗固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白125I標(biāo)記的二抗第32頁/共91頁2.放射性抗體檢測法過程第33頁/共91頁3.Broome-Gilbert雙位點(diǎn)檢測法質(zhì)?；駻插入基因B表達(dá)質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白檢測融合蛋白。既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物。第34頁/共91頁固相支持濾膜抗A抗體125I標(biāo)記的抗B抗體質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支持濾膜抗A抗體發(fā)光，底片曝光第35頁/共91頁二、免疫沉淀檢測法把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插入基因的表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落周圍時，就會與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈”。1.原理抗原—抗體凝集反應(yīng)。檢測分泌型產(chǎn)物。2.方法第36頁/共91頁對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。第37頁/共91頁三、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbant(免疫吸收劑)assay1.原理：一抗（primaryantibody）:

與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。二抗（secondaryantibody）：

與一抗的特異性結(jié)合。酶連（enzyme-linke）：

二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測目標(biāo)分子的含量。第38頁/共91頁待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶

待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗無色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶

第39頁/共91頁2.ELISA檢測的一般步驟（1）固定樣品將待測樣品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底?？椎椎?0頁/共91頁加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。（2）一抗結(jié)合一抗第41頁/共91頁加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。（3）二抗結(jié)合二抗第42頁/共91頁加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。（4）顯色反應(yīng)第43頁/共91頁第44頁/共91頁在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。（5）比色第45頁/共91頁3.ELISA的局限性有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（monoclonalantibody）:由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。第46頁/共91頁臨床檢驗(yàn)常用的單抗第47頁/共91頁四、免疫印跡（westernblotting）法1.原理：在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶。（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷。①SDS:（SDS）：第48頁/共91頁②聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量大?。ㄦ湹拈L短），從而把不同分子量的肽鏈分開。電泳buffer電泳buffer第49頁/共91頁點(diǎn)樣電泳方向第50頁/共91頁③蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計(jì)。商品化供應(yīng)Da道爾頓(質(zhì)量單位,等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。一克約為6×1023道爾頓第51頁/共91頁Dalton第52頁/共91頁④凝膠中的蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍(lán)：靈敏度低、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。

硝酸銀：靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。1）直接染色第53頁/共91頁直接染色電泳結(jié)果第54頁/共91頁（2）Westernblotting電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等）。①Western（轉(zhuǎn)膜）膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。膜膠蛋白第55頁/共91頁Western裝置第56頁/共91頁②Blotting原理與ELISA相同。待測蛋白硝酸纖維素膜一抗二抗辣根過氧化物酶底物產(chǎn)物，并發(fā)出光PAGE膠待測蛋白底片曝光辣根過氧化物酶：HRPO第57頁/共91頁第58頁/共91頁1）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與

膜上的蛋白結(jié)合。2）洗去未結(jié)合的一抗。3）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有HRPO）。4）清洗掉未結(jié)合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，沖洗膠片。③Blotting過程第59頁/共91頁④結(jié)果單抗blotting結(jié)果第60頁/共91頁一、無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)第六節(jié)

轉(zhuǎn)譯篩選法

能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物。如：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物系統(tǒng)。借助無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，通過表達(dá)或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。第61頁/共91頁二、轉(zhuǎn)譯篩選mRNA無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)35S標(biāo)記的甲硫氨酸翻譯35S標(biāo)記的肽鏈PAGE電泳放射自顯影比較放射性帶紋的位置載體+外源DNA轉(zhuǎn)錄與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符？第62頁/共91頁三、雜交抑制轉(zhuǎn)譯法mRNA一旦與DNA雜交成RNA-DNA雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被抑制）。單鏈mRNA核糖體小亞基核糖體大亞基能翻譯mRNADNA核糖體小亞基核糖體大亞基不能翻譯1.原理第63頁/共91頁2.過程第64頁/共91頁四、雜交釋放轉(zhuǎn)譯法1.原理：在高甲酰胺溶液中載體上克隆的cDNA與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對應(yīng)的mRNA，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等）。第65頁/共91頁2.過程硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA總mRNAcDNA基因的mRNA雜交洗脫cDNA基因的mRNA體外翻譯cDNA編碼的蛋白電泳凝膠放射自顯影cDNA編碼的蛋白硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA收集35S標(biāo)記的氨基酸第66頁/共91頁專門設(shè)計(jì)檢測能同DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。待測蛋白質(zhì)硝酸纖維素濾膜能與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列放射性標(biāo)記待測蛋白質(zhì)硝酸纖維素濾膜能與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列放射性標(biāo)記五、DNA-蛋白質(zhì)相互作用篩選法第67頁/共91頁一般克隆與篩選策略第68頁/共91頁第七節(jié)

幾種常用的真核生物重組基因選擇方法真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶（dihydrofolatereductase，DHFR）一、哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的選擇標(biāo)記1.胸苷激酶（thymidinekinase,tk）（1）TK選擇原理①四氫葉酸的必要性DHFR第69頁/共91頁②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似物。能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷dATP、dCTP和dTTP的合成：dUMP

dATP

TTP

dCTP

氨甲喋啉

抑制

抑制

第70頁/共91頁④胸苷酸激酶的補(bǔ)救作用TK+細(xì)胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培養(yǎng)基中的胸苷（T）合成dTTP，存活。Ttk③次黃嘌呤的補(bǔ)救作用細(xì)胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和dCTP。dUMP

dATP

dTTP

dCTP

次黃嘌呤

補(bǔ)救

氨甲喋啉

抑制

抑制

第71頁/共91頁①HAT培養(yǎng)基：Tk-

細(xì)胞株。TK基因。②宿主細(xì)胞③載體標(biāo)記（2）TK選擇過程含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培養(yǎng)基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有轉(zhuǎn)入TK基因的細(xì)胞才能生存。第72頁/共91頁第73頁/共91頁真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。2.二氫葉酸還原酶基因（DHFR）（1）

選擇原理①二氫葉酸還原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氫葉酸四氫葉酸第74頁/共91頁DHFR+細(xì)胞二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸DHFR+細(xì)胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸。能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存不需要補(bǔ)救！第75頁/共91頁DHFR-

細(xì)胞DHFR-

細(xì)胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以不能合成四氫葉酸。需要補(bǔ)救！不能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存。第76頁/共91頁②胸腺嘧啶和次黃嘌呤補(bǔ)救dUMPdATPTTPdATP次黃嘌呤補(bǔ)救胸苷補(bǔ)救無四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時，胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補(bǔ)救:第77頁/共91頁DHFR-細(xì)胞株（不能在無核苷酸的培養(yǎng)基中生長）。①

宿主細(xì)胞（2）選擇過程透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補(bǔ)救。②

無核苷酸的培養(yǎng)基需要胸腺嘧啶和次黃嘌呤補(bǔ)救！第78頁/共91頁③

氨甲喋呤“加壓”添加少量氨甲喋啉抑制內(nèi)源性DHFR的補(bǔ)救作用，可提高選擇。DHFR+基因。④載體標(biāo)記只有轉(zhuǎn)入DHFR+基因的細(xì)胞才能生存。DHFR-DHFR-DHFR+DHFR+livedie無核苷酸的培養(yǎng)基第79頁/共91頁是細(xì)菌抗生素，干擾細(xì)菌的核糖體，使細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成不能正常進(jìn)行，但不影響真核生物。3.新霉素抗性基因（neor）（1）選擇原理①新霉素（neomycin）新霉素的類似物，是一種

氨基糖苷，對真核細(xì)胞和原核細(xì)胞都有毒性。②G418（geneticin）第80頁/共91頁③新霉素抗性基因--neor細(xì)菌的新霉素抗性基因（neor）編碼一種磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH），能使G418失活。G418真核細(xì)胞死亡G418存活neor真核細(xì)胞第81頁/共91頁含致死劑量G418的完全培養(yǎng)基。①G418培養(yǎng)基真核細(xì)胞株均可。neor基因。②宿主細(xì)胞③載體標(biāo)記（2）選擇過程G418：（100-800g/mL）第82頁/共91頁CAT是由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9編碼的，催化氯霉素發(fā)生乙?；Щ?。氯霉素cat含氯霉素的完全培養(yǎng)基。真核細(xì)胞株均可。cat基因。乙酰氯霉素4.氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）（1）選擇原理（2）

選擇條件（3）

宿主細(xì)胞（4）載體標(biāo)記chloramphenicolacetyltransferase第83頁/共91頁在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞提取物中測定是否有乙酰氯霉素。（5）

CAT分析方法②免疫學(xué)檢查：用抗CAT的血清進(jìn)行Westernblot或ELISA，檢查CAT的表達(dá)。Anti-CA