單細胞凝膠電泳第1頁/共21頁單細胞凝膠電泳技術(singlecellgelelectrophoresis,SCGE)，也稱彗星試驗(cometassay)，是OstlingO和JohansonKJ首次提出，后經(jīng)Singh等進一步完善的一種在單個細胞水平上檢測DNA損傷、交聯(lián)和修復的方法。因其簡單、靈敏、低耗、快速等優(yōu)點而廣泛應用于生物檢測、遺傳毒理、流行病學調(diào)查等諸多方面。第2頁/共21頁一、實驗原理DNA鏈多為磷酸復合物，在生理條件下DNA的多聚核酸鏈多呈陰離子狀態(tài)，當外源性因素（如紫外照射）造成DNA鏈斷裂時，負超螺旋結構變得松散，那么在電場作用下DNA就會以一定速率向正極移動。在細胞裂解液作用下，細胞膜、核膜等結構受到破壞，胞內(nèi)蛋白質(zhì)、RNA及其它成分均擴散到溶液中，而核DNA由于分子量大而只能留在原位。第3頁/共21頁經(jīng)堿處理和在堿性電解質(zhì)的作用后，DNA解旋，損傷的DNA斷鏈及其片段會被釋放出來，而在電泳條件下，DNA片段可進入凝膠孔隙發(fā)生遷移。由于這些DNA分子量很小，所以在電泳過程中會離開核DNA向正極移動，形成彗星狀的圖像。在一定條件下，DNA遷移距離和DNA含量分布與DNA損傷程度呈線性相關。隨著DNA損傷程度加劇，斷片數(shù)目增加，表現(xiàn)為尾部DNA含量增加，彗尾延長，熒光強度加強。第4頁/共21頁二、實驗流程采用堿性SCGE，其基本操作過程包括：第5頁/共21頁1.細胞制取取處于對數(shù)生長期的Hela細胞，吹打為單細胞懸液，用PBS調(diào)節(jié)細胞密度為105-106

個/ml。第6頁/共21頁2.細胞染毒染毒組：取1ml細胞懸液加入10-3MH2O2

溶液50μl，混勻，37℃水浴30min；陰性對照組：取1ml細胞懸液加入50μlPBS緩沖液，同等條件下水浴30min。第7頁/共21頁3.制片第一層膠：在完全磨毛的載玻片上鋪180μL質(zhì)量分數(shù)為1%的正常熔點瓊脂糖(NMA)，室溫固化10min；可將玻片用吹風機稍微加熱，以延緩瓊脂糖凝固。

第8頁/共21頁第二層膠：取50μL質(zhì)量分數(shù)為0.8%的低熔點瓊脂糖（LMA）和30μL的細胞懸液，混勻后滴加于第一層膠上，加該蓋片使其均勻鋪開，4℃凝固10min；

第9頁/共21頁第三層膠：移開蓋片，滴加100μL質(zhì)量分數(shù)為0.5%的LMA于第二層膠上，加蓋片，4℃凝固10min。

第10頁/共21頁4.裂解將制好的凝膠放入冷的裂解液中，4℃下裂解2小時；裂解液使用時新配(鋪完第二層膠后即可配制)90mllysissolution10mlDMSO1mlTriton-X100第11頁/共21頁5.解旋從裂解液中將載玻片取出，在蒸餾水中洗去過多鹽，晾干。將新配制的電泳緩沖液倒入電泳槽中，約覆過載玻片0.25cm，蓋上蓋子，在高pH電泳緩沖液中放置20min以便DNA解螺旋。第12頁/共21頁6.電泳室溫下調(diào)節(jié)緩沖液液面高低，于20V，200mA下電泳20min。第13頁/共21頁7.中和將凝膠浸入0.4MTris緩沖液（pH7.5）中，浸洗30min。第14頁/共21頁8.染色觀察用20μg/L的吖啶橙染色3－5min，用雙蒸水洗掉表面的染料，24小時內(nèi)在熒光顯微鏡下觀察。第15頁/共21頁

三結果觀察第16頁/共21頁第17頁/共21頁第18頁/共21頁四注意事項實驗操作均在紅光或暗處條件下進行，以避免造成DNA的額外損傷。關鍵步驟是鋪膠，尤其是第一層膠，一定要平整，均勻。若有氣泡，用下一層膠填平。配制裂解液時，DMSO為致癌劑，注意安全。用去尖的槍頭取Triton-X