食品微生物檢驗(yàn)

規(guī)范操作基礎(chǔ)培訓(xùn)

1清洗、消毒和滅菌操作

主要內(nèi)容：§1清洗、消毒和滅菌操作§2培養(yǎng)基的制備§3采樣和取、制樣§4接種、分離純化§5制片、染色及顯微觀察§6實(shí)驗(yàn)室安全基礎(chǔ)知識(shí)§1

清洗、消毒和滅菌操作1.1玻璃器皿的清洗

1.1.1新購的玻璃器皿堿性玻璃浸泡于１mol/L鹽酸浸泡過夜，中和玻璃中的堿性物質(zhì)。1.1.2用過的玻璃器皿污染的器皿，必須經(jīng)過適當(dāng)消毒，污跡不能洗凈時(shí)，可浸泡于洗液內(nèi)。1.1.3洗液的配制稱取重鉻酸鉀100g與1000mL水置大燒瓶中加熱攪拌溶化，待冷卻后，將燒瓶置冷水中，慢慢加入濃流酸250mL，并不斷攪拌。消毒滅菌的方法

（一）物理消毒滅菌法（二）化學(xué)消毒法

（一）物理消毒滅菌法

1.熱力滅菌法

熱力滅菌法分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。在同一溫度下，后者效力比前者為大，這是因?yàn)椋海?）濕熱中細(xì)菌菌體蛋白較易凝固；（2）濕熱的穿透力比干熱大；（3）濕熱的蒸汽有潛熱存在。水由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)釋放出的潛熱，可迅速提高被滅菌物體的溫度。加熱滅菌和加熱消毒的方法

干熱滅菌法

火焰滅菌法干燥加熱空氣滅菌法高溫滅菌巴氏消毒法常壓下煮沸消毒法濕熱滅菌法間歇滅菌法常規(guī)加壓滅菌法加壓下(高壓蒸汽滅菌法)連續(xù)加壓滅菌法濕熱滅菌法1.煮沸法：1個(gè)大氣壓下，煮沸的水溫為100℃，一般細(xì)菌繁殖體煮沸5～10分鐘即被殺死。細(xì)菌芽胞常需煮沸1～２小時(shí)，才被殺死。水中加入2%碳酸鈉，可提高沸點(diǎn)達(dá)105℃，促進(jìn)細(xì)菌芽胞的殺滅。2.巴氏消毒法（pasteurization）:用較低溫度殺滅液體中的病原菌、同時(shí)又不影響消毒物品的營養(yǎng)成分及香味的消毒方法。加熱61.1～62.8℃半小時(shí)即可，常用于牛奶和酒類等的消毒。

3.間歇滅菌法（郭霍氏蒸汽消毒）:將待滅菌的物品100℃加熱15～30分鐘，殺死其中的細(xì)菌繁殖體，然后將物品置于37℃溫箱中過夜使芽胞發(fā)育成繁殖體，次日再通過流通蒸汽加熱，如此連續(xù)三次，可將所有細(xì)菌繁殖體和芽胞全部殺死。針對(duì)有點(diǎn)培養(yǎng)基和牛奶、糖等在100℃以上有效成分易被破壞的產(chǎn)品進(jìn)行滅菌。

4.高壓蒸汽滅菌法：是滅菌效果最好、目前應(yīng)用最廣的滅菌方法。方法是在一密閉蒸鍋—高壓蒸汽滅菌器內(nèi)進(jìn)行的。通常采用純飽和蒸汽壓為103.4kPa，溫度達(dá)121℃,維持15～30分鐘，可殺死包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)的所有微生物。適用于各種耐熱、體積大的培養(yǎng)基的滅菌，也適用于玻璃器皿、工作服、耐高溫塑料用品等物品的滅菌。

在高壓蒸汽滅菌前要確保高壓鍋中的所有冷空氣已經(jīng)排空，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對(duì)應(yīng)關(guān)系，這樣會(huì)大大降低滅菌效果。定期對(duì)滅菌效果進(jìn)行監(jiān)測和驗(yàn)證，可采用：

物理監(jiān)測法（留點(diǎn)溫度計(jì)法、熱電偶法）；

化學(xué)指示劑法（化學(xué)指示膠帶、指示卡等）；

生物指示法（孢子懸液、孢子條帶等）監(jiān)控高壓滅菌的效果。3.濾過除菌

采用機(jī)械方法，設(shè)計(jì)一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子，做成各種過濾器。通過過濾，只讓液體培養(yǎng)基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在篩子上面，從而達(dá)到除菌的目的。這種滅菌方法適用于一些對(duì)熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基的滅菌以及氣體的滅菌。它的最大優(yōu)點(diǎn)是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。

濾過除菌主要用于一些不耐高溫滅菌的血清、毒素、抗生素、藥液、空氣等除菌。但是比細(xì)菌還小的病毒仍然能留在液體培養(yǎng)基內(nèi)，有時(shí)會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來一定的麻煩。

濾菌器的種類很多，目前常用的有蔡氏濾菌器、玻璃濾器、薄膜濾器。

（二）化學(xué)消毒法

化學(xué)藥物根據(jù)其抑菌或殺死微生物的效應(yīng)分為殺菌劑、消毒劑、防腐劑三類。1.凡殺死一切微生物及其孢子的藥劑稱殺菌劑；2.只殺死感染性病原微生物的藥劑稱消毒劑；3.只能抑制微生物生長和繁殖的藥劑稱為防腐劑。但三者界限往往難以區(qū)分?；瘜W(xué)藥劑的效應(yīng)與藥劑濃度、處理時(shí)間長短和菌的敏感性均有關(guān)系，主要仍取決于藥劑濃度。大多數(shù)殺菌劑在低濃度下只起抑菌作用或消毒作用。它們的殺菌或抑菌原理基本相同。實(shí)驗(yàn)室中常用的化學(xué)殺菌劑和消毒劑列于下表。有機(jī)酸乳酸醋酸苯甲酸山梨酸丙酸鹽80%或0.33～1mol/L3～5mL/m30.1%0.1%0.32%熏蒸空氣(接種室、培養(yǎng)室)熏蒸空氣食品防腐劑(抑制真菌)食品防腐劑(抑制霉菌)食品防腐劑(抑制霉菌)破壞細(xì)胞膜和酶類無機(jī)酸堿類硫酸燒堿NaOH石灰水0.01mol/L4%1%～3%適用于玻璃器皿浸泡病毒性傳染病糞便消毒、畜舍消毒破壞細(xì)胞膜和酶類氧化劑高錳酸鉀漂白粉過氧化氫氯氣碘0.1%～3%1%～5%3%0.2～1.0ppm2.5%皮膚、水果、茶具消毒洗刷培養(yǎng)室、飲水及糞便消毒(對(duì)噬菌體有效)清洗傷口飲用水消毒皮膚消毒蛋白質(zhì)或酶氧化變性重金屬昇汞(HgCl2)汞溴紅(紅藥水)硝酸銀硫酸銅0.05%～0.2%2%0.1%～1.0%與石灰水配成波爾多液非金屬表面器皿及組織分離體表及傷口消毒新生兒眼藥水真菌、藻類殺菌劑，防治植病蛋白質(zhì)變性，酶失活金屬螯合劑8-羥奎啉硫酸鹽0.1%～0.2%外用(清洗、消毒)生化試劑緩沖液的防腐劑與酶的激活劑或金屬活性基結(jié)合，使酶失活去污劑新潔爾滅(原液為5%季胺鹽)肥皂0.25%1：10001：5000皮膚及器皿消毒浸泡用過的蓋片、載片皮膚清潔劑破壞細(xì)胞膜；使蛋白質(zhì)變性染料結(jié)晶紫2%～4%體表及傷口消毒與細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中核酸結(jié)合，破壞其生理功能接種室、培養(yǎng)室空氣熏蒸消毒甲醛熏蒸消毒法（1）加熱熏蒸按熏蒸空間計(jì)算，量取甲醛溶液，盛在小燒杯或白瓷坩堝內(nèi)，用鐵架支好，點(diǎn)燃酒精燈，關(guān)閉室門。甲醛溶液煮沸揮發(fā)，酒精燈最好能在甲醛蒸完后即自行熄滅。所需酒精的量要加以控制。（2）氧化熏蒸稱取高錳酸鉀（相當(dāng)于甲醛用量的1/2）于一白瓷坩堝或玻璃燒杯內(nèi)，再量取定量的甲醛溶液，準(zhǔn)備妥當(dāng)后，把甲醛溶液倒在盛有高錳酸鉀的器皿內(nèi)，立即關(guān)門。甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種強(qiáng)氧化劑，當(dāng)它與一部分甲醛溶液作用時(shí)，由氧化作用產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛溶液揮發(fā)為氣體。甲醛溶液熏蒸