第9章化學(xué)鍵表示的底物分子如同左邊象棋比賽中已經(jīng)落入圈套的國(guó)王，被裂解運(yùn)。理看到酶采用結(jié)合能誘導(dǎo)匹配和一些特殊的催化策略協(xié)助底物形成轉(zhuǎn)化態(tài)。乳蛋白酶，就是要將缺乏催化劑和pH7.0幾乎不發(fā)生的反應(yīng)(蛋白質(zhì)水解）進(jìn)行下去。碳酸EcoRVNMP激酶，要解決的問(wèn)ATP轉(zhuǎn)移給另一個(gè)核苷酸（而不會(huì)轉(zhuǎn)移到水分子?；疪NA分子，但是蛋白質(zhì)酶所采用的催化原則同樣適用于RNA催化劑。在第8章我們知道底物與酶結(jié)合啟動(dòng)催化。結(jié)合能是酶和底物之間形成大量弱相互作，的一個(gè)組氨酸殘基有助于Zn2+H2O復(fù)合物丟失一個(gè)質(zhì)子，產(chǎn)生OH離子。顯著增加反應(yīng)速度。NMP激酶將兩種核苷酸放置在一塊有助于磷酸基團(tuán)從一個(gè)核苷酸OHZn2+穩(wěn)定帶負(fù)電荷的。EcoRV的Mg2+所起的作用就是穩(wěn)定。最后金屬離子也NMPATP作為底物的酶，其金屬離子是底物和酶結(jié)合的橋梁，生物體內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換是一個(gè)重要過(guò)程（第23章。已經(jīng)完成自身任務(wù)的蛋白質(zhì)必須降解的半衰期（pH值）10~1000年。但是在有些生化過(guò)程中，肽鍵的水解必由于C-N鍵具有雙鍵特征，兩個(gè)原子之間結(jié)合力進(jìn)一步加強(qiáng)。羰基碳原子對(duì)親電的敏9.19.29.1胰凝乳蛋白酶的特異性。胰凝乳蛋白酶裂解芳香氨基酸或大的疏水氨基酸（已經(jīng)用9.2胰凝乳蛋白酶有一個(gè)很活潑的絲氨酸。DIPF28個(gè)絲氨酸殘基中195位絲氨酸與DIPF反應(yīng)，導(dǎo)致胰凝乳蛋白酶失活。N-，產(chǎn)生黃色化合物對(duì)酚（圖9.3。光吸收數(shù)值能夠測(cè)定對(duì)酚的產(chǎn)量。圖9.3顏色底物。胰凝乳蛋白酶水解N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-酚酯產(chǎn)生黃色產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚。在pH7.0，對(duì)酚解離。在穩(wěn)態(tài)條件下，胰凝乳蛋白酶對(duì)這個(gè)底物的裂解遵循米氏動(dòng)力學(xué)，Km20M，kcat是77s-1。停留法(stopped-flowmethod)檢測(cè)反應(yīng)的起始狀態(tài)，能夠在毫秒范圍內(nèi)混合酶和（9.4圖9.4胰凝乳蛋白酶催化的動(dòng)力學(xué)。胰凝乳蛋白酶水解N-乙酰-L-苯丙氨酸-p-酚酯9.5（A）絲氨酸是三殘基（包括天冬氨酸和組氨酸）1967年DavidBlow解析了胰凝乳蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)。初看上去，胰凝乳蛋白酶是球Ser195，位于酶表面的裂縫中（9.6Ser195特別活潑（9.7。Ser195His57的咪唑環(huán)形成氫鍵。咪唑環(huán)的NHAsp102形成氫鍵?；钚晕稽c(diǎn)氨基Ser195Ser殘基側(cè)鏈，極化Ser側(cè)鏈的羥基（去質(zhì)子。底物存在時(shí)，His57側(cè)受Ser195側(cè)鏈羥His57是堿催化劑。Ser195丟失氫離子，產(chǎn)生烷基氧離子。烷基氧離子的親核性比羥基大得多。Asp102協(xié)助His57定位，通過(guò)氫鍵和靜電相互作用使His57更能接受Ser195的質(zhì)子。9.6胰凝乳蛋白酶催化活性位點(diǎn)的位置。胰凝乳蛋白酶有三條多肽鏈，分別用橘色、藍(lán)Ser195,其排列位置處于蛋白分子上半部分。整個(gè)分子的不同位置還有兩個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵和9.7催化三聯(lián)體。Ser195轉(zhuǎn)化成強(qiáng)親核試劑（右邊這些觀察提示胰凝乳蛋白酶的一種肽水解的機(jī)制（9.8。第一步底物與酶結(jié)合。然后酶分子的r195的氧子親核目標(biāo)肽鍵的羰基碳原子（第2產(chǎn)生四個(gè)原子與羰基碳原子結(jié)合（從平面結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成四面體結(jié)構(gòu)（羰基原來(lái)的氧原子帶有負(fù)電荷H基團(tuán)（圖9.9）相互用穩(wěn)定，從而穩(wěn)定羰基碳原子四面體（轉(zhuǎn)化態(tài)。第三步，四面體產(chǎn)生酰7的正電荷側(cè)鏈給要斷裂肽鍵的氨基提供質(zhì)子。第四步，斷裂肽鍵的氨基成分離開(kāi)酶，完成水解反應(yīng)的第一階段反應(yīng)（酶的?；?。第二階段是酶的脫酰反應(yīng)。水分子占據(jù)先前底物氨基成分所在的位置（5步24步。作為堿催化劑，His57的咪唑環(huán)吸收水分子的質(zhì)子，產(chǎn)生的OH離子?；奶荚?，形成四面體碳原子（第6步。斷裂形成羧基（His57作為酸催化劑（7步。最后，釋放羧酸產(chǎn)物（8步9.8胰凝乳蛋白酶水解肽鍵的催化反應(yīng)。肽水解可以解釋共價(jià)催化和酸堿催化機(jī)制。反（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）圖9.9氧負(fù)離子洞。胰凝乳蛋白酶促反應(yīng)的氧負(fù)離子用氧負(fù)離子洞穩(wěn)定。氧負(fù)離洞的肽鍵NH與氧負(fù)離子形成氫鍵（綠色虛線袋，成為S1口袋，適于長(zhǎng)的非極性氨基酸側(cè)鏈。適當(dāng)側(cè)鏈與該口袋結(jié)合將鄰位肽鍵定位于斷裂位點(diǎn)（9.10N-端的氨基酸側(cè)9.11他殘基。斷裂肽鍵的N-端殘基分別稱為P1，P2，P3（從C-斷向N-端編號(hào)，斷裂肽鍵C-端氨基酸殘基分別是P1',P2',P3'（從N-端向C-端編號(hào)。相應(yīng)地，結(jié)合這些位點(diǎn)的口袋對(duì)應(yīng)地稱為S1,S2或S1',S2'等。9.10胰凝乳蛋白酶特異性口袋。胰凝乳蛋白酶底物結(jié)合口袋用相對(duì)疏水的殘基構(gòu)建、很深，有助于結(jié)合長(zhǎng)的疏水性殘基如苯丙氨酸（綠色）側(cè)鏈?；钚晕稽c(diǎn)195位Ser定位在斷圖9.11蛋白酶和底物先互作用名方法。底物與酶潛在的相互作用位點(diǎn)用紅色的P表S表示。斷裂肽鍵（用紅色標(biāo)出）9.12C端肽鍵，胰蛋白酶斷裂長(zhǎng)的帶正電荷氨基酸（即精氨酸和賴氨酸）C-端肽鍵，彈性蛋白酶斷裂側(cè)鏈小的氨基酸（如甘氨酸、絲氨酸）C-端肽鍵。比較它們的S1口袋，發(fā)現(xiàn)底物特異性差異的原因在于S1口袋結(jié)構(gòu)的細(xì)小差異。胰蛋白酶的S1口袋大，底部有一個(gè)Asp189酸性氨基酸，而胰凝乳蛋白酶同樣位點(diǎn)是絲氨酸。天冬氨酸能夠吸引，穩(wěn)定底物分子帶正電荷的精氨酸、賴氨酸殘基與酶分子結(jié)合。彈性蛋白酶的口袋兩邊有兩個(gè)Val，分Val190Val216。這兩個(gè)氨基酸殘基的側(cè)鏈擠占口袋空間，使之只能容納小側(cè)鏈的氨基酸殘基（圖9.139.12胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的結(jié)構(gòu)類似性。將胰凝乳蛋白酶（紅色）碳原子誤差是1.7A。9.9S1口袋。有些氨基酸殘基在決定這些胰凝乳蛋白酶的其他成員包括參與血液凝固的蛋白酶（在第10章討論，以及腫（PSA69.149.14枯草桿菌的催化三體和氧負(fù)離子洞。氧負(fù)離子洞的兩個(gè)氨基分別來(lái)自肽鏈骨架氨基和Asn155的側(cè)鏈氨基。這兩個(gè)氨基能夠穩(wěn)定活性中心Ser221親核肽鍵碳原子所形成9.15II。II的結(jié)構(gòu)（右邊，有兩條肽鏈（II有催化三體，但是這個(gè)酶與胰凝乳蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶都沒(méi)有明顯的類似性（圖9.15是用賴氨酸側(cè)鏈氨基或肽鏈N-端氨基活化。AlaAsp32，His64，和Ser221，然后測(cè)定各突變蛋白酶切模式底物的活性(圖9.16)。如同所料，活性位點(diǎn)Ser221突變成Ala顯著降低催化活性，kcat值只有野生酶kcat的百萬(wàn)分之一，Km值變化不大。Km值比野生酶Km值高兩倍以內(nèi)。His64突變成Ala64Ser221Ala突變相當(dāng)，Asp32Ala32隊(duì)酶活性的影響幅度His64Ser221單位點(diǎn)突變的效果相當(dāng)。這些結(jié)果支持“活性中心是催化pH8.6時(shí)，這些突變體的催化蛋白水解的速度仍然比沒(méi)有酶催化的蛋白水解速度快1000倍。9.16枯草桿菌蛋白酶定點(diǎn)突變。催化三體的殘基突變成丙氨酸后，測(cè)定酶促活性。任一該位點(diǎn)的突變氨基酸。Uncat是沒(méi)有催化劑的反應(yīng)效率（估計(jì)值。定點(diǎn)突變也能研究氧離子洞對(duì)催化反應(yīng)的重要性。Asn155突變成甘氨酸能消除枯草桿菌氧負(fù)離子洞的一個(gè)氨基，kcat0.2%，Km值增加兩倍。這些結(jié)果顯NH基團(tuán)在穩(wěn)定羰基碳四面體中間物以及形成該四面體的轉(zhuǎn)化態(tài)方面起重要并非所有的蛋白水解酶都使用活化絲氨酸殘基，還有其它活活殘基水解肽鍵（9.17（2）（3）金屬蛋白水解酶。各種蛋白酶都產(chǎn)生一種親核試劑，肽鍵羰基碳原子（9.18殘基活化的半胱氨酸親核肽鍵(圖9.18)的方式與絲氨酸蛋白酶絲氨酸頗為相似。研究最深入的半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶(papain)。這個(gè)酶是從木離的。與木瓜蛋白酶用。在進(jìn)化過(guò)程中，半胱氨酸蛋白酶至少獨(dú)立出現(xiàn)兩次。Caspases也是半胱氨酸蛋白酶，9.18及其它反轉(zhuǎn)錄中，這兩個(gè)考貝已經(jīng)融合成編碼一條多肽鏈的（圖9.19。這圖9.17三類蛋白酶及其活性位點(diǎn)。半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶分別圖9.18三類蛋白酶的活化策略。肽鍵羰基受到下列基團(tuán)：(A)半胱氨酸蛋白酶中組氨（B）金屬活化的水分子。金屬蛋白酶中字母B表示堿（常常是天冬氨酸消化酶羧肽酶A是經(jīng)典的鋅離子蛋白酶。嗜熱菌蛋白酶是鋅蛋白酶成員。這個(gè)很大，包括基質(zhì)金屬蛋白酶（負(fù)責(zé)組織重構(gòu)和組織降解。但是羧肽酶A不屬于這一。（2）肽鍵的羰基，和（3）穩(wěn)定四面體中間物（圖9.18captopril就是血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶（ACE）的抑制劑。這個(gè)酶就是一個(gè)金屬蛋白酶。Indinavir(Crixivan),retrovir,和其他20多種治療AIDS的藥物是HIV蛋白酶抑制劑。HIV蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶。這個(gè)蛋白酶能夠?qū)⒍喙δ苡虻牡鞍踪|(zhì)水解成活性形式。徹底這一過(guò)程使失去能力（圖9.19）為了避免抑制劑的副作用，用作藥物的蛋白酶抑制劑必需只抑制目標(biāo)酶，9.19HIV蛋白酶是二聚體天冬氨酸蛋白酶。這個(gè)蛋白酶是兩個(gè)完全相同的亞基構(gòu)成的二聚體（分別用藍(lán)色和黃色表示。每個(gè)亞基有99個(gè)氨基酸。每個(gè)亞基給活性位點(diǎn)提供一個(gè)9.20IndinavirHIV蛋白酶抑制劑。Indinavir(crixivan)HIV蛋白酶底物多肽IndinavirHIV蛋白酶的多肽底物相似。Indinavir的醇與四面體中間物很相似，其它9.20性位點(diǎn)，indinavir采用的構(gòu)型能夠接近于蛋白酶蛋白的二重對(duì)稱結(jié)構(gòu)（9.21。結(jié)合后HIV蛋白酶活性位點(diǎn)為可變翼蓋住。抑制劑中心醇的羥基與活性位點(diǎn)的兩個(gè)Asp相互作用。此外，抑制劑的兩個(gè)羰基與水分子形成氫鍵（9.21沒(méi)有繪出，而這些水分子又NH基團(tuán)形成氫鍵。抑制劑與水分子和酶分子相互之間的這種互作模式，是定indinavir抑制HIV的特異性。9.21HIV蛋白酶-indinavir（左邊）HIVindinavir結(jié)CO2是有氧代謝的最終產(chǎn)物。哺乳動(dòng)物的CO2釋放到血液并被到肺呼出。在紅細(xì)CO2與水反應(yīng)生成碳酸（7.3節(jié)。反應(yīng)產(chǎn)物是中等強(qiáng)度的酸（即碳酸pKa即使沒(méi)有催化劑，CO237pH條件下，二級(jí)反應(yīng)的速k10.0027Ms-1。因?yàn)樗肿訚舛仁?5.5M，因此該反應(yīng)的速度常數(shù)相當(dāng)于一級(jí)k1=0.15s-1CO2的逆反應(yīng)速度更快（k-150s-1。相應(yīng)的平衡常數(shù)K1=5.4x10-5，即[CO2]與[H2CO3]在平衡時(shí)的濃度比達(dá)到340:1。CO2水合和HCO3脫水常常與快速過(guò)程（尤其是過(guò)程）偶聯(lián)。因此幾乎所有生物液流過(guò)肺，碳酸脫水酶將HCO3脫水生成CO2。相反，碳酸脫水酶能夠?qū)O2水合生成HCO3HCO3和CO2是不同酶促反應(yīng)的產(chǎn)物或底物?？焖貶CO3CO2才能保證這些分子處于合適的濃度水平。這些酶促反應(yīng)非常重要。碳酸脫水酶突變會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)硬化（osteopetrosis）(密度過(guò)高，伴隨貧血)和精神。CO2HCO3CO2的速度達(dá)到kcat106s-1100萬(wàn)分子?；镜奈锢磉^(guò)程如擴(kuò)散和質(zhì)子轉(zhuǎn)移達(dá)在發(fā)現(xiàn)碳酸脫水酶（1932年）10年后，人們發(fā)現(xiàn)這個(gè)酶有鋅離子。而且證實(shí)鋅離子1/3的酶要么含有金屬離子，要么利用金屬離子少有7種碳酸脫水酶（每種酶都有自身。這些碳酸脫水酶序列一致性明顯，是同源9.229.22II（左邊）II的三個(gè)生物體內(nèi)的Zn均是+2價(jià)。鋅原子基本上總是與四個(gè)或配體結(jié)合。在碳酸脫水酶情況取決于pH值）占居第四個(gè)配位。由于占據(jù)配位鍵的分子是中性，因此Zn(His)3單位pH9.239.23pH對(duì)碳酸退水酶活性的影響。pHII酶促二氧化碳水合反應(yīng)速度改變。最大反應(yīng)速度的pH值很高。pH8，反應(yīng)速度接近最大值。pHpH7.0反應(yīng)速度降低一半，提示pH7.0失去一個(gè)基團(tuán)(pKa=7.0)的一半，這個(gè)基團(tuán)對(duì)催化反應(yīng)很重要。而且這個(gè)曲線顯示，高pH值（脫質(zhì)子）形成該基團(tuán)能有效地催化。盡管有些氨基酸，如組氨酸的pKa值接近7，但是不同提示負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化的基團(tuán)不是氨基酸而是鋅結(jié)合的水分子。9.24pKa值。pKa15.77。9.24著pKa值降低，很多水分子在中性pH值就發(fā)生解離，產(chǎn)生足夠濃度的氫氧根離子（結(jié)合于Zn原子。鋅結(jié)合的氫氧根離子是很強(qiáng)的親核試劑，CO2的能力比水分子強(qiáng)的多。鋅結(jié)合氫氧根離子的重要性提示二氧化碳水合的簡(jiǎn)單機(jī)制（圖9.25H+HCO39.25碳酸脫水酶催化二氧化碳水合反應(yīng)的機(jī)制。鋅離子結(jié)合羥基進(jìn)行水合的機(jī)制顯示（1）（2）合；OH親核CO2（4）水分子替代碳酸氫根。用合成類似物進(jìn)行的研究顯示這種機(jī)制有道理。合成的配體有四個(gè)氮原子與鋅離子結(jié)合（碳酸脫水酶是三個(gè)配位鍵（9.26a8.pKa值那么低但比pKapH9.2100以上。盡管催化速度比碳酸脫水酶低很多，但是模型系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示鋅結(jié)合氫氧根離子的機(jī)制是正確的。碳酸脫水酶進(jìn)化使之能夠利用鋅結(jié)合的氫氧根離子作為強(qiáng)催化劑。 圖9.26（A）化學(xué)合成的一個(gè)能夠結(jié)合鋅離子的類似物，CO2水合速度提高100（B）假定的化合物-鋅離子復(fù)合物結(jié)構(gòu)，顯示鋅離子結(jié)合配體氮原子后還能結(jié)合一如同我們?cè)缦人?，有些碳酸脫水酶催化二氧化碳的水合速度達(dá)到106s-1。如此之高的9.27合）的速度受氫離子擴(kuò)散速度限制。質(zhì)子擴(kuò)散速度的二級(jí)反應(yīng)常數(shù)接近10-11M-1s-1，因此逆反應(yīng)的速度k-1肯定低于1011M-1s-1。由于平衡常數(shù)K等于k1/k-1，因此正反應(yīng)得速度常數(shù)k1=Kk-1。如果k-1≤1011M-1s-1，K=10-7M(因?yàn)閜Ka=7)，則k1≤104s-1。換句話說(shuō)，梔子的擴(kuò)散速度限定質(zhì)子的釋放常數(shù)低于104s-1（當(dāng)基團(tuán)的pKa=7)。但是二氧化碳的水合速度達(dá)到106s-1，因此圖9.25的各個(gè)步驟都得加快。如何解決這個(gè) 9.27水脫質(zhì)子的動(dòng)力學(xué)。碳酸脫水酶中鋅離子結(jié)合水分子的脫質(zhì)子反應(yīng)和結(jié)合質(zhì)子反的組分參與了酶促反應(yīng)。緩沖液能夠結(jié)合或釋放質(zhì)子。因此在中性pH時(shí)，質(zhì)子或氫氧根離子的濃度限定在10-7M，緩沖液中相應(yīng)離子的濃度也許比這個(gè)數(shù)值高出很多，達(dá)到毫摩pH79.281k1’[B]。k1’k-1’109M-1s-1。而緩沖液濃度高于[B]=10-3M（1mM106M-1s-1(k1’×[B]=(109M-1s-1)×(10-3M)=106s-1。這種預(yù)測(cè)為實(shí)驗(yàn)證實(shí)（9.299.28緩沖液對(duì)脫質(zhì)子反應(yīng)的影響。B9.29緩沖液濃度對(duì)碳酸脫水酶催化二氧化碳水合反應(yīng)速度的影響。1,2-二甲II有一種His64。這個(gè)氨基酸殘基能夠?qū)\結(jié)合水分子的質(zhì)子傳遞到蛋白質(zhì)表面，然后地送給緩沖液（9.30。碳9.30（1）His64消除鋅離子結(jié)合水的質(zhì)子，產(chǎn)生親核氫氧根離子和質(zhì)（2）緩沖液B從這個(gè)組氨酸移去質(zhì)子，再生沒(méi)有質(zhì)子化的組氨酸。同一進(jìn)化(convergentevolution)CO2CalvinMethanosarcinathermophila中鑒定的脫水酶三個(gè)亞基之間的界面（9.31。酶蛋白分子有非常顯著的左手螺旋結(jié)構(gòu)（鏈圖9.31（左邊）碳酸脫水酶的鋅離子位點(diǎn)。鋅離子與三個(gè)組氨酸和一個(gè)（中間）A，BC。每條鏈主要現(xiàn)在看看DNA水解反應(yīng)。細(xì)菌和古生菌有一套保護(hù)自己免受的機(jī)制。很多病毒將自己的組注入細(xì)胞。一旦DNA進(jìn)入細(xì)胞，就能挾持細(xì)胞相關(guān)機(jī)器合成的保護(hù)機(jī)制是用限制性內(nèi)切酶（也稱限制酶）降解剛剛侵入細(xì)胞的DNA。這些酶能識(shí)別目標(biāo)核酸的特定序列（即識(shí)別序列或識(shí)別位點(diǎn)，在特定位置斷裂DNA。前面我們?cè)诨忻甘荌I型限制酶，它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部斷裂DNA。其它類型的限制性核酸內(nèi)切酶的切DNADNA分子，不得水解沒(méi)有識(shí)別序列的核酸分子。如何使限制性內(nèi)切酶只水解DNA而不水解自身DNA?在大腸桿菌，限制酶EcoRV斷裂含有5’-GATATC-3’的DNA雙鏈。但是EcoRV卻并不斷裂含有幾百個(gè)這樣的序列的大腸桿菌。宿主DNA受到甲基化酶的保護(hù)。甲基化酶能夠使宿主的識(shí)別序列的腺嘌呤甲基化（圖9.23。一旦宿主識(shí)別位點(diǎn)腺嘌呤被甲基化，基化酶將宿主DNA相應(yīng)位點(diǎn)甲基化（作相應(yīng)的標(biāo)記。這些成對(duì)的酶就是細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)（restriction-modificationsystems9.32DNA。EcoRV的識(shí)別序列（左邊DNA的甲限制性內(nèi)切酶只斷裂識(shí)別位點(diǎn)沒(méi)有修飾的DNA，不水解其它DNA序列。6核苷酸序46（4096種，因此不被這個(gè)酶酶切的六核苷酸序列相當(dāng)于該酶能夠酶切的六核苷酸序列的4000倍以上。也就是說(shuō)，限制性內(nèi)切酶斷裂識(shí)別位點(diǎn)的效率比它斷4000倍?，F(xiàn)在看看是什么機(jī)制使限制酶具有如此高的酶切特異用鎂活化的水分子替代磷的3’-O，使DNA斷DNA骨架的磷酸二酯鍵水解。3’-OP原子之間的化學(xué)鍵斷裂。斷裂位點(diǎn)形成的產(chǎn)物3’-端是羥基，5’-端是磷酸（圖9.33。該反應(yīng)是水分子親核磷原子。類比蛋白酶水解機(jī)制，提示核酸酶水解的兩種機(jī)制。機(jī)制1是利用一個(gè)強(qiáng)親核試劑，經(jīng)過(guò)共價(jià)，限制性內(nèi)切酶斷裂DNA。機(jī)制2是直接水解。9.33磷酸二酯鍵水解。DNA磷酸二酯鍵水解的產(chǎn)物是磷酸處于5’-端。斷裂化學(xué)鍵用紅色標(biāo)出。機(jī)制一（共價(jià)機(jī)制二（直接水解用兩種親核試劑磷所形成的產(chǎn)物支持流水線替代正確有磷原子的構(gòu)型發(fā)生反轉(zhuǎn)，類似于四面體碳原子R和S型構(gòu)型轉(zhuǎn)換（2.1節(jié)。當(dāng)于胰凝乳蛋白酶的Ser195）磷原子形成共價(jià)連接的，然后水解形成最終產(chǎn)P3’A和T之間的磷酸二酯鍵。第一步合成斷裂位點(diǎn)是硫代磷酸的EcoRV底物（圖9.34裂。酶促反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有共價(jià)這一步（圖9.35。9.34用硫代磷酸標(biāo)記。EcoRV能9.35DNA裂解得立體化學(xué)。EcoRV（18O16O原子結(jié)合。這一結(jié)果強(qiáng)烈提示限制性內(nèi)切酶促反應(yīng)是水分子直接磷原子作用于含磷酸底物的很多酶，其催化活性需要Mg2+或類似的二價(jià)陽(yáng)離子。限制性內(nèi)切Mg2+或類似的二價(jià)陽(yáng)離子才有催化活性。這些金屬離子的作用是什么？在Mg2+或類似的二價(jià)陽(yáng)離子存在的情況下，將酶蛋白與底物分子結(jié)晶能夠直接觀察酶Mg2+或類似的二價(jià)陽(yáng)離子時(shí)，將Ca2+Mg2+，將酶蛋白、底物和金屬離子子協(xié)助水分子定位，并活化水分子（類似碳酸脫水酶的Zn2+活化水分子，結(jié)合的水分子9.36圖9.36 EcoRV核酸內(nèi)切酶的一個(gè)Mg2+結(jié)合位點(diǎn)。鎂離子活化水分子，協(xié)助水分子定DNA這樣的識(shí)別位點(diǎn)，其空間結(jié)構(gòu)是二重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱（圖9.379.37EcoRV（A）識(shí)別序列是圍繞軸（綠色）DNA配體（即底物）的識(shí)別。蛋白質(zhì)與帶有識(shí)別9.38基分別是黃色和藍(lán)色。DNA骨架用紅色標(biāo)出。注意酶分子的二重對(duì)稱軸和DNA的二重對(duì)Mg2+DNADNAEcoRVEcoRV只酶切配體DNA？答案在于酶蛋白與配體DNA在之間有一系列獨(dú)特的相互作用。5’-GATATC-3’序列中，5’-GA與每個(gè)亞基的環(huán)（凸出在酶蛋白外）的氨基酸殘基相互作用（圖9.39。酶與配體DNA結(jié)合形成復(fù)合物的最顯著特征是DNA發(fā)生，9.39EcoRVDNA底物分子之間形成的氫鍵EcoRVDNA（綠色）DNABCGEcoRV酶蛋白CTAEcoRV酶蛋白分子的氨基酸殘基。與非配體DNA形成的復(fù)合物，結(jié)構(gòu)與此差異明顯。非配體DNA與EcoRV的結(jié)合基本9.419.36配體DNA與EcoRV結(jié)合不能構(gòu)建出完整的酶促反應(yīng)的活性位點(diǎn)。底物及隨后的Mg2+結(jié)合解釋了EcoRV酶切配體底物的特異性比酶切非配體DNA特異性高100萬(wàn)倍的理由。圖9.40識(shí)別位點(diǎn)的。DNA用球-棒模型表示。DNA雙螺旋軸用紅線表示。與酶結(jié)合發(fā)生明顯。B型DNA雙螺旋軸是直的(沒(méi)有繪出)9.41EcoRVDNA分子的結(jié)合DNA(橘色)DNA(紅色)與EcoRV酶蛋白分子的結(jié)合。注意非配體DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合因距離太遠(yuǎn)，無(wú)法構(gòu)建完整的現(xiàn)在看看DNA與EcoRV的結(jié)合能對(duì)催化特異性的貢獻(xiàn)DNA增加了酶分子與9.42DNA和非配體DNA結(jié)合能量相當(dāng)，親和力幾乎沒(méi)有差別。但是，配體DNA與EcoRV的結(jié)合使DNA雙鏈發(fā)生構(gòu)成了一個(gè)完整的Mg2+結(jié)合位點(diǎn)，能夠?qū)嵤┟复呋牧呀夥磻?yīng)。DNADNA9.42DNADNAEcoRV的結(jié)合能高。DNAEcoRV分子結(jié)合多余的結(jié)合能（與非配體DNA-EcoRV復(fù)合物相比）用于DNA，從而構(gòu)建出完整DNA的機(jī)制能夠解釋甲基化限制性內(nèi)切酶活性，從而保護(hù)宿主DNA的機(jī)制。宿主EcoRV甲基化酶使5’-GATATC-3’的5’-端腺嘌呤堿基發(fā)生甲基化。腺嘌呤氨基的甲基Asn185的側(cè)鏈羰基無(wú)法形成氫鍵（9.43Asn185與蛋白質(zhì)的其它氨基酸殘基相關(guān)聯(lián)，Asn185與這個(gè)腺嘌呤堿基形成氫鍵就能夠使酶分子其它氨基酸殘基與DNA進(jìn)一步相互作用。Asn185與DNA形成氫鍵，其它作用就不可能發(fā)生，DNA分子也不會(huì)，酶催化的蛋白質(zhì)裂解也不會(huì)產(chǎn)生。圖9.43腺嘌呤甲基化。腺嘌呤甲基化EcoRV與配體DNA之間形成氫鍵，因此DNA第II類限制性內(nèi)切酶有相同的催化核，可能是水平轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的，類限制性核酸內(nèi)切酶顯示大多數(shù)蛋白之間沒(méi)有顯著的氨基酸序列相似性。但是這些酶天冬氨酸（有些情況下是谷氨酸）的鏈構(gòu)成的Mg2+結(jié)合位點(diǎn)（圖9.44，圖9.44II類限制性內(nèi)切酶有保守的結(jié)構(gòu)。用顏色重點(diǎn)標(biāo)出每個(gè)酶蛋白二聚體的單一這些觀察顯示很多IIII類限制性內(nèi)切酶可能是從帶有編碼這類酶的其它生物水平轉(zhuǎn)移獲得的。這種轉(zhuǎn)移（如經(jīng)過(guò)質(zhì)粒EcoRI和RhodobactersphaeroidesRsrI，26650%，明顯地說(shuō)明兩者進(jìn)化密切。同一來(lái)源獲得這個(gè)蛋白得編碼。此外，EcoRI的遺傳子與大多數(shù)大腸桿菌所用的遺傳子差異很大，也提示這個(gè)很晚才進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞，而不是來(lái)自大腸桿菌kinase9.45把NTP的磷酸轉(zhuǎn)移給水分子（即NTP水解反應(yīng)。看到這些酶如何利用誘導(dǎo)匹配來(lái)9.45（ATP）NMPP-X-NMP激酶。這些酶蛋白結(jié)晶時(shí)要么是游離酶，要么是9.46，9.47結(jié)構(gòu)特征是第一個(gè)鏈與第一個(gè)螺旋之間形成的環(huán)，典型地有氨基酸序列Gly-X-X-X-9.48會(huì)遇到，很多重要的核苷酸結(jié)合蛋白都含有類似的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域有P-環(huán)。9.46這些同源的核苷酸激酶及其它相關(guān)蛋白中，都有核苷三磷酸結(jié)合域。這個(gè)結(jié)構(gòu)域是一疊片層，兩邊都是螺旋（用紫色表示。圖9.47核苷單磷酸激酶域。P-環(huán)用綠色表示。虛線表示域以外的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)9.48P-ATP的相互作用。ATP（黑色）磷酸基團(tuán)之間的相互作用。注意綠色虛線是ATP與肽鏈NH基和一個(gè)保守Lys相互作用形成的氫鍵（綠色。Mg2+Mn2+ATP而典型的胞內(nèi)Mg2+濃度是毫摩爾濃度水平。因此在細(xì)胞內(nèi)所有的核苷酸磷酸都是以圖 M2+與核苷三磷酸結(jié)合如何促進(jìn)催化？Mg2+與磷酸氧原子的相互作用將核苷酸構(gòu)型固（9.4