第三章天然產(chǎn)物提取分離方法

第一節(jié)提取方法一.中草藥中各類化學(xué)成分簡(jiǎn)介（一）有效成分1.堿性化合物：

生物堿小檗堿2.酸性化合物：結(jié)構(gòu)中含有酚羥基的化合物——黃酮、醌類、苯丙素（香豆素、木脂素）及其苷類結(jié)構(gòu)中含有羧基的化合物——有機(jī)酸、葡萄糖醛酸黃酮蒽醌香豆素木脂素3.兩性化合物：結(jié)構(gòu)中既有堿性基團(tuán)也有酸性基團(tuán)氨基酸、蛋白質(zhì)4.中性化合物：分子結(jié)構(gòu)中既無堿性基團(tuán)也無酸性基團(tuán)的化合物，如萜類和揮發(fā)油、甾體等。（二）無效成分

1.脂溶性蠟－高級(jí)不飽和脂肪酸（16－30碳）和高級(jí)一元醇結(jié)合的酯脂肪油－不飽和脂肪酸（鏈長(zhǎng)短不一）與丙三醇形成的甘油酯，通常稱為混合甘油酯。

葉綠素及胡蘿卜素

2.水溶性

多糖類－淀粉、纖維素、樹膠、果膠、粘液質(zhì)多元酚類化合物－鞣質(zhì)二、中草藥有效成分的提取

（一）溶劑提取法（二）水蒸汽蒸餾法（三）升華法（一）溶劑提取法是根據(jù)天然藥物中各種成分在溶劑中的溶解性質(zhì)，選用對(duì)有效成分溶解度大，而對(duì)不需要溶出成分溶解度小的溶劑，將有效成分從藥材組織中溶解出來的辦法。溶劑提取法溶解規(guī)律溶劑類型提取方法溶劑可分為：水、親水性和親脂性有機(jī)溶劑常用溶劑：極性由弱到強(qiáng)依次排序?yàn)槭兔眩妓穆然迹急剑级燃淄椋悸确拢家颐眩家宜嵋阴ィ颊〈迹急家掖迹技状迹妓蝗芙馕镔|(zhì)也有親水性及親脂性之分。溶質(zhì)在溶劑當(dāng)中的溶解遵循相似相溶的原理，親水性的化學(xué)成分易溶于水或親水性的有機(jī)溶劑中，親脂性的成分易溶于親脂性的有機(jī)溶劑中。

石油醚→油脂、蠟、葉綠素、揮發(fā)油、游離甾體及三萜類化合物氯仿或醋酸乙酯→游離生物堿、有機(jī)酸及黃酮、香豆素的苷元丙酮或乙醇、甲醇→苷類、生物堿鹽、鞣質(zhì)等水→氨基酸、糖類、無機(jī)鹽等常用的溶劑提取法1.冷提法（1）浸漬法（2）滲漉法2.熱提法（1）煎煮法（2）回流提取法（3）連續(xù)回流提取法冷提法（1）浸漬法：是用水或醇浸漬藥材一定時(shí)間，然后合并提取液，并將其減壓濃縮的方法。該法因?yàn)橐话愣际窃诘蜏叵逻M(jìn)行的，不用加熱，所以適合于揮發(fā)性成分及受熱易分解成分的提取。但提取的時(shí)間較長(zhǎng)，效率低。用水浸提時(shí)還要注意提取液的防腐問題。（2）滲漉法：是將藥材裝入滲漉筒中，先用水或醇浸漬數(shù)小時(shí)，然后從滲漉筒的下口使提取液流出，上口不斷地加入新的溶劑，此方法因?yàn)樗幉呐c溶劑之間能夠始終保持較大的濃度差，因此提取效率較高。該法同樣適用于揮發(fā)性及受熱易破壞分解的成分的提取。但是有溶劑耗費(fèi)量較大的缺點(diǎn)。滲漉裝置2.熱提法（1）煎煮法：該方法是我國(guó)中醫(yī)中藥最早使用的傳統(tǒng)的提取方法。是將藥材用水加熱煮沸提取，在提取過程當(dāng)中大部分成分可被不同程度的提取出來，但是對(duì)于揮發(fā)性成分及加熱易被破壞的成分不宜使用。（2）回流提取法：是用有機(jī)溶劑作為提取溶劑，在回流裝置中對(duì)藥材進(jìn)行加熱回流提取，該方法提取效率較高，但因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間加熱，所以不適合受熱易破壞分解的成分。（3）連續(xù)回流提取法：是回流提取法的發(fā)展，具有消耗溶劑量更小，提取效率更高的優(yōu)點(diǎn)。常用索氏提取器或連續(xù)回流裝置。

索式提取器連續(xù)回流提取

6.萃取瓶（圓底燒瓶）1.冷凝管2.脂肪提取器3.濾紙筒4.虹吸管5.蒸汽管索氏提取器水－是一種強(qiáng)極性溶劑。無機(jī)鹽、糖類、分子不太大的多糖、鞣質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸鹽、生物堿鹽和極性苷類等都能被水溶出。以水作為提取溶劑的缺點(diǎn)是：提出的雜質(zhì)多。冷提法提出的雜質(zhì)少且對(duì)熱不穩(wěn)定的成分較適宜，提取效率低；而熱提法的效率高，但對(duì)熱不穩(wěn)定的成分不適宜，特別不適于揮發(fā)性成分和淀粉、粘液質(zhì)多的藥材的提取。親水性有機(jī)溶劑－也就是一般所說的與水能混溶的有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，其中以乙醇最為常用。具有經(jīng)濟(jì)、安全、無毒；對(duì)細(xì)胞的穿透能力強(qiáng)；大多數(shù)天然成分都可溶解等優(yōu)點(diǎn)，常稱為萬能溶劑。

（二）水蒸汽蒸餾法

適用于具有揮發(fā)性、能隨水蒸汽蒸餾而不被破壞、難溶或不溶于水的成分的提取，如揮發(fā)油、小分子的香豆素類、小分子的醌類成分。

（三）升華法

固體物質(zhì)受熱不經(jīng)過熔融，直接汽化，遇冷后又凝固為固體化合物，稱為升華。中草藥中有一些成分具有升華的性質(zhì)，可以利用升華法直接自中草藥中提取出來。如樟腦、咖啡因。第二節(jié)有效成分的純化（一）重結(jié)晶（二）兩相溶劑萃取法（三）沉淀法（四）吸附法（五）鹽析法（六）透析法結(jié)晶和重結(jié)晶1.結(jié)晶的條件4.純度的判斷3.結(jié)晶的方法2.溶劑的選擇結(jié)晶與重結(jié)晶第三節(jié)色譜分離法一、吸附色譜法（一）概述吸附色譜法基本原理吸附劑/固定相洗脫劑/流動(dòng)相操作方式被分離的物質(zhì)1.硅膠一種酸性吸附劑，使用于分離中性和酸性成分（1）用法（2）型號(hào)2.氧化鋁由氫氧化鋁灼燒而得，分為堿性、中性和酸性三種（1）用法（2）型號(hào)吸附劑3.活性炭非極性吸附劑作用分離氨基酸、糖類和苷類等水溶性成分4.C18極性順序：石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<乙醚氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸<水混合溶劑

洗脫劑1.極性吸附劑被分離得化合物極性基團(tuán)極性越大、數(shù)量越多吸附力越強(qiáng)，共軛雙鍵越多吸附力越強(qiáng)。2.非極性吸附劑極性越小吸附力越強(qiáng)。被分離得物質(zhì)1.正向柱大極性物質(zhì)后出峰2.反相柱大極性物質(zhì)先出峰洗脫條件的確定（二）操作方式操作方式柱色譜薄層色譜中藥柱層析設(shè)備二、分配色譜法（一）基本原理分配色譜法基本原理正相分配色譜反相分配色譜正相色譜極性物質(zhì)吸附強(qiáng)小極性物質(zhì)吸附弱后出先出反相色譜極性物質(zhì)吸附弱小極性物質(zhì)吸附強(qiáng)先出后出（二）支持劑（三）操作方式

1.紙色譜

2.分配薄層色譜

3.分配柱色譜（一）聚酰胺結(jié)構(gòu)聚酰胺色譜法（二）基本理論－氫鍵吸附強(qiáng)度的影響因素1.溶劑種類2.化合物結(jié)構(gòu)（1）形成氫鍵的基團(tuán)越多，吸附越牢。（2）形成氫鍵基團(tuán)的位置不同，吸附強(qiáng)度不同。（3）芳香化程度越高，共軛程度越多吸附性越強(qiáng)。（4）形成分子內(nèi)氫鍵則吸附強(qiáng)度減弱。聚酰胺柱色譜洗脫劑聚酰胺操作步驟：裝柱上樣洗脫三、離子交換色譜法離子交換色譜法原理操作裝柱上樣洗脫四、大孔吸附樹脂法五、凝膠色譜法

1.分類

2.分離原理

3.應(yīng)用六、高效液相色譜法七、氣相色譜法島津GC2010

第四節(jié)天然藥物有效成分結(jié)構(gòu)測(cè)定一、結(jié)構(gòu)測(cè)定的主要程序第四節(jié)天然藥物有效成分結(jié)構(gòu)測(cè)定一、結(jié)構(gòu)測(cè)定的主要程序純度鑒定推測(cè)母體結(jié)構(gòu)類型功能基情況分子量分子式的確定波譜、化學(xué)方法推測(cè)出結(jié)構(gòu)式人工合成進(jìn)行確認(rèn)結(jié)構(gòu)測(cè)定的程序純度確定--最基本的條件檢查純度的方法：外觀、顏色、形態(tài)是否均一；

測(cè)定各種物理常數(shù)，如熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、比旋光度、折光率等，這些物理常數(shù)都反映了化合物的純度。如果可能是已知物，用已知結(jié)構(gòu)的對(duì)照品進(jìn)行對(duì)照測(cè)定或測(cè)定它們的共熔點(diǎn)等；也可對(duì)照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)值（注意各種測(cè)定條件的一致性）薄層層析（三種展開系統(tǒng)和三種顯色方法）高效液相層析；●某些成分或功能基，可以和一些特定試劑產(chǎn)生各種顏色或沉淀，有助于判斷化合物類型和功能基：生物堿類大都能和生物堿沉淀試劑產(chǎn)生沉淀；羥基葸醌類遇堿呈紅色；

鹽酸一鎂粉試劑能和許多黃酮類化合物呈色。化學(xué)方法—輔助手段●鑒別功能基的化學(xué)反應(yīng)：三氯化鐵反應(yīng)、三氯化鋁反應(yīng)等等。

利用在酸水或堿水中的溶解度情況，提示該化合物堿性功能基或酸性功能基的存在以及有無內(nèi)酯、內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)。利用在酸水或堿水中的溶解度情況，提示該化合物堿性功能基或酸性功能基的存在以及有無內(nèi)酯、內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)。●化學(xué)降解法

將復(fù)雜分子通過氧化、還原等化學(xué)反應(yīng)，降解為幾個(gè)結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單又穩(wěn)定的小分子化合物，通過對(duì)降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定，再按降解機(jī)理合理地推導(dǎo)出原來可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。化學(xué)降解法●特點(diǎn)：需用化合物量大；反應(yīng)劇烈；主要產(chǎn)物得率少又費(fèi)時(shí)；

現(xiàn)在較少應(yīng)用，僅保留一些比較簡(jiǎn)單規(guī)律性又較強(qiáng)的降解反應(yīng)●衍生物制備－用化學(xué)方法研究結(jié)構(gòu)的一種常用手段，對(duì)結(jié)構(gòu)推定有一定意義。波譜方法—主要手段UVIRMSNMR四大光譜紫外光譜用波長(zhǎng)在200～400nm之間的連續(xù)光掃描記錄下來的圖譜，吸收帶比較寬；紅外光譜

用波長(zhǎng)在800nm～20μm之間的連續(xù)光掃描記錄下來的圖譜，譜線比較尖銳；光譜島津2450/2550PC傅立葉變換紅外光譜儀光譜儀器核磁共振儀質(zhì)譜儀測(cè)定范圍：波數(shù)200～400nm之間作用：

提供基本骨架信息;樣品中雜質(zhì)的測(cè)定

定量分析特點(diǎn)：

液態(tài)樣品才能測(cè)定；常規(guī)紫外光譜儀價(jià)格低廉；樣品用量少（只需5-10μg）紫外光譜(Ultra-Violet,UV)生色團(tuán)產(chǎn)生紫外吸收的不飽和基團(tuán)，如C=C,C=O,O=N=O等；助色團(tuán)：其本身是飽和基團(tuán)（常含有雜原子），它連到生色團(tuán)上時(shí)，能使后者吸收波長(zhǎng)變長(zhǎng)或吸收強(qiáng)度增加，如-OH,-NH2,-Cl等；深色位移：由于基團(tuán)取代或溶劑效應(yīng)，最大吸收波長(zhǎng)變長(zhǎng)，也叫紅移（redshift）；淺色位移：由于基團(tuán)取代或溶劑效應(yīng)，最大吸收波長(zhǎng)變短，也叫藍(lán)移（blueshift）；紫外光譜(Ultra-Violet,UV)具有相同基本骨架化合物的UV光譜相同，但并非是同一化合物；測(cè)定范圍波數(shù)600～4000cm-1之間，其中1600cm-1以上為化合物的特征基團(tuán)區(qū)，1000-500cm-1為指紋區(qū)。作用

主要用于定性分析，功能基的確認(rèn)，芳環(huán)取代類型的判斷等。優(yōu)點(diǎn)：任何氣態(tài)、液態(tài)、固態(tài)樣品均可測(cè)定；每種化合物都有紅外吸收；常規(guī)紅外光譜儀價(jià)格低廉；樣品用量少（只需5-10μg）紅外光譜(Infra-Red,IR)特征基團(tuán)區(qū)指紋區(qū)三要素：位置、強(qiáng)度、峰形-OHCH3OH-C-O-C=O●如果被測(cè)定物是已知物，只要和已知對(duì)照品做一張共紅外光譜圖，二者紅外光譜完全一致則為同一物質(zhì)；●如無對(duì)照品也可檢索有關(guān)紅外光譜數(shù)據(jù)圖譜文獻(xiàn)?！?/p>

1945年，F(xiàn).Bloch和E.M.Purcell幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)了核磁共振現(xiàn)象，獲得1952年諾貝爾物理獎(jiǎng)?！窈舜殴舱駜x器的發(fā)展：

406090100300500600750

MHz●核磁共振：●天然藥物化學(xué)成分以有機(jī)物為主，分子結(jié)構(gòu)中必然有C、H原子，它們的結(jié)合類型、化學(xué)環(huán)境不同，均可用NMR測(cè)定，是天然化合物結(jié)構(gòu)測(cè)定的重要手段。

氫核磁共振（1H-NMR)譜碳核磁共振（13C-NMR)譜核磁共振譜(NuclearMagneticResonance,NMR)●氫核磁共振（1H-NMR)譜：化學(xué)位移范圍：在0～20ppm三大要素：化學(xué)位移(ppm)、偶合常數(shù)(J)及峰面積。靈敏度高，樣品用量少（1～5mg），測(cè)試時(shí)間短●碳核磁共振（13C-NMR)譜：化學(xué)位移范圍：在0～250ppm要素：化學(xué)位移(ppm)靈敏度較低，樣品用量較多（5～20mg），測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)C=OC=C-OCH2溶劑C=CDEPT-135適用范圍：信號(hào)過于復(fù)雜、重疊嚴(yán)重時(shí)，而對(duì)結(jié)構(gòu)推斷產(chǎn)生困難時(shí)，可以簡(jiǎn)化譜圖，有助判斷；特點(diǎn)：對(duì)測(cè)試儀器要求比較高（超導(dǎo)核磁共振儀）；譜圖測(cè)試