關(guān)于細(xì)胞凋亡與衰老第一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三概念：細(xì)胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程，也常常被稱為細(xì)胞程序死亡（programmedcelldeath，PCD）。凋亡細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞吞噬。第二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三細(xì)胞凋亡的生理和病理學(xué)意義生理學(xué)意義1.生長發(fā)育：組織與器官的塑造（趾的分化）；動物變態(tài)；皮膚角質(zhì)形成；2.免疫細(xì)胞分化：克隆選擇；3.防御：清除衰老細(xì)胞、DNA損傷的細(xì)胞、和被病原體感染的細(xì)胞。第三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三病理學(xué)意義1.病原體侵染；誘導(dǎo)凋亡——HIV抑制凋亡——Poxvirus2.細(xì)胞凋亡不足腫瘤，自身免疫疾病；3.細(xì)胞凋亡過度神經(jīng)退行性疾?。ˋD，帕金森癥）、心肌梗塞、再生障礙性貧血、骨組織壞死。第四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射線（紫外線，射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等◆化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細(xì)胞生長因子，腫瘤壞死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等第五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三細(xì)胞凋亡的檢測方法1.形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察

2.DNA電泳——ladder3.流式細(xì)胞技術(shù)

4.彗星電泳法（cometassay）

5.AnnexinV檢測細(xì)胞膜外表面PS(磷脂酰絲氨酸)6.TUNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法第六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三區(qū)別點(diǎn)細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死起因生理或病理性病理性變化或劇烈損傷范圍單個散在細(xì)胞大片組織或成群細(xì)胞細(xì)胞膜保持完整，一直到形成凋亡小體破損染色質(zhì)凝聚在核膜下呈半月狀呈絮狀細(xì)胞器無明顯變化腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)崩解細(xì)胞體積固縮變小腫脹變大凋亡小體有，被鄰近細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬無，細(xì)胞自溶，殘余碎片被巨噬細(xì)胞吞噬基因組DNA有控降解，電泳圖譜呈梯狀隨機(jī)降解，電泳圖譜呈涂抹狀蛋白質(zhì)合成有無調(diào)節(jié)過程受基因調(diào)控被動進(jìn)行炎癥反應(yīng)無，不釋放細(xì)胞內(nèi)容物有，釋放內(nèi)容物。第七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三常用檢測細(xì)胞凋亡的染料：二乙酸熒光素（FDA），綠色熒光，活細(xì)胞染色。Hoechst33342或33258，DAPI，吖啶橙（AO），半通透，凋亡和固定后的細(xì)胞熒光較強(qiáng)。溴化乙啶（EB）、碘化丙啶（PI）、放線菌素D（7-AAD），不通透，正常和凋亡細(xì)胞拒染。可用不同性質(zhì)的染料對凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色。第八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三

細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理

線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。 第九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三Caspase家族與凋亡◆Caspase家族

Caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteineasparticacicspecificprotease，即Caspase.Caspase1即ICE(白介素-1b轉(zhuǎn)換酶),是Ced3在哺乳動物細(xì)胞中的同源蛋白.第十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三Caspase家族與凋亡

Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點(diǎn)裂解活化或自身活化Caspase活化第十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三胞外信號分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑

當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號分子(Fas,TNF等)后，凋亡細(xì)胞表面信號分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptorprotein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡.

下游Caspases活化后，作用于底物，裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNALadder;裂解參與細(xì)胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜脂PS重排，便于吞噬細(xì)胞識別并吞噬。第十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三Bcl-2家族、線粒體與細(xì)胞凋亡◆Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細(xì)胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域；Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個保守的Bcl-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3第十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三Bcl-2、線粒體與細(xì)胞凋亡

當(dāng)Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另一方面使Bid裂解成2個片段，其中含BH3結(jié)構(gòu)域的C-端片段被運(yùn)送到線粒體，與Bcl-2/Bax的BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放。CytC與胞質(zhì)中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosisproteaseactivatingfactor)結(jié)合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起細(xì)胞凋亡.第十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三Apaf-1凋亡酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1），線蟲的同源物為ced-4。作用：參與線粒體凋亡途徑，該基因敲除后，小鼠神經(jīng)細(xì)胞過多，腦畸形發(fā)育。Apaf-1與cytc、ATP/dATP結(jié)合后，召集caspase-9，形成凋亡體（apoptosome），激活caspase-3，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)。第十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三FasFas又稱作APO-1/CD95，屬TNF受體家族。Fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺細(xì)胞，激活的T和B淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，肝、脾、肺、心、腦、腸、睪丸和卵巢細(xì)胞等。Fas蛋白與Fas配體結(jié)合后，會激活caspase，導(dǎo)致靶細(xì)胞走向凋亡。第十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三p53

是一種抑癌基因，其生物學(xué)功能是監(jiān)視DNA的完整性。如有損傷，則抑制細(xì)胞增殖，直到DNA修復(fù)完成。如果DNA不能被修復(fù)，則誘導(dǎo)其調(diào)亡第十七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三myc

在許多人類惡性腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有c-myc的過度表達(dá)，它能促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制分化。在凋亡細(xì)胞中c-myc也是高表達(dá)，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，一方面它能激活那些控制細(xì)胞增殖的基因，另一方面也激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，給細(xì)胞兩種選擇：增殖或凋亡。當(dāng)生長因子存在，Bcl-2基因表達(dá)時，促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之細(xì)胞凋亡。第十八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三細(xì)胞凋亡的途徑

細(xì)胞凋亡的途徑主要有兩條，一條是通過胞外信號激活細(xì)胞內(nèi)的caspase、另一條是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化的caspase可將細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白降解，引起細(xì)胞凋亡。第十九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三1．Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡――凋亡受體途徑細(xì)胞表面的凋亡受體是屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族的跨膜蛋白，它們包括Fas（Apo-1/CD95）、TNFR1、DR3/WSL、DR4/TRAIL-R1和DR5/TRAIL-R2。其配體屬于TNF家族，目前已比較清楚的是Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。第二十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三2．線粒體與細(xì)胞凋亡細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)或凋亡信號能引起線粒體細(xì)胞色素c釋放，作為凋亡誘導(dǎo)因子，細(xì)胞色素c能與Apaf-1、caspase-9前體、ATP/dATP形成凋亡復(fù)合體（apoptosome），然后召集并激活caspase-3，進(jìn)而引發(fā)caspases級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。第二十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三細(xì)胞自噬-細(xì)胞中壽命較長蛋白的降解方式由溶酶體進(jìn)行降解細(xì)胞中出現(xiàn)雙層膜包被的自噬泡-自噬小體細(xì)胞可通過自噬自我銷毀分子機(jī)制了解較少,明確的有PI3K第二十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三

細(xì)胞衰老

(cellularaging或cellsenescence)●Hayflick界限(HayflickLimitation）●細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老●衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化●細(xì)胞衰老的分子機(jī)理第二十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三復(fù)制性衰老（replicativesenescence）細(xì)胞的增殖次數(shù)是有限的，稱“Hayflick”界限。如人胚成纖維細(xì)胞可培養(yǎng)60-70代。DNA每復(fù)制一次端粒就縮短一段，到一定程度時，則激活DNA損傷檢驗(yàn)，細(xì)胞凋亡。人的成纖維細(xì)胞端粒每年縮短14-18bp。端粒酶可修復(fù)端粒，此酶僅在干細(xì)胞中表達(dá)。第二十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三

細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老●在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生●正常情況下終生保持分裂的細(xì)胞，其分裂能力是否隨著有機(jī)體年齡的增高而下降？它們會不會衰老？◆衰老動物體內(nèi)，細(xì)胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明顯延長◆衰老個體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細(xì)胞的增殖和衰老◆骨髓干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)說明隨著年齡的增加，干細(xì)胞增殖速度也趨緩慢第二十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三

衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化●細(xì)胞核的變化●內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化:衰老動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分彌散性地分散于核周胞質(zhì)中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量似乎是減少了●線粒體的變化 ◆通常，細(xì)胞中線粒體的數(shù)量隨齡減少，而其體積則隨齡增大●致密體的生成第二十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三

衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化●膜系統(tǒng)的變化

◆衰老的細(xì)胞，其膜流動性降低、韌性減小◆衰老細(xì)胞間間隙連接及膜內(nèi)顆粒的分布也發(fā)生變化第二十七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三核增大、染色深、核內(nèi)有包含物染色質(zhì)凝聚、固縮、碎裂、溶解質(zhì)膜粘度增加、流動性降低細(xì)胞質(zhì)色素積聚、空泡形成線粒體數(shù)目減少、體積增大、mtDNA突變或丟失高爾基體碎裂尼氏體消失包含物糖原減少、脂肪積聚核膜內(nèi)陷

衰老細(xì)胞的形態(tài)變化第二十八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三分子水平的變化1.

DNA：復(fù)制與轉(zhuǎn)錄受阻，端粒DNA、mtDNA缺失。DNA氧化、斷裂、缺失和交聯(lián)，甲基化程度降低。2.

RNA：含量減少。3.

蛋白質(zhì)：合成下降，發(fā)生修飾、交聯(lián)。4.

酶分子：物理與化學(xué)特征改變，酶失活。5.

脂類：不飽和脂肪酸被氧化。第二十九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三細(xì)胞衰老的分子機(jī)理1.代謝廢物積累：如：脂褐質(zhì)，老年性癡呆（AD）腦細(xì)胞內(nèi)的β-淀粉樣蛋白。2.線粒體DNA突變：線粒體自由基濃度高，mtDNA是裸露分子，容易發(fā)生突變。腦、心、骨骼肌的氧負(fù)荷最大，組織最易衰老。caloricrestriction能延長大鼠壽命50%-70%。第三十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期三●氧化性損傷學(xué)說:

該理論認(rèn)為，代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或分子（reactiveoxygenspecies，ROS）引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導(dǎo)致衰老。ROS主要有三種類型：

◆

O2-，即超氧自由基；

◆

OH-，即羥自由基；

◆

H2O2。它們的高度活性引發(fā)脂類、蛋白質(zhì)和核酸分子的氧化性損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)