-.z蟬蛻多糖的別離純化實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆斩嗵堑膭e離純化方法。實(shí)驗(yàn)原理：根據(jù)相似相容的特點(diǎn)，糖類易溶于水，不容于有機(jī)溶劑，可用水提醇沉的方法進(jìn)展提取。采用醇沉法獲得的多糖?；煊休^多的蛋白質(zhì)，可用鹽酸法除去蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)材料蟬蛻95％乙醇鹽酸蒸餾水電熱鼓風(fēng)枯燥箱粉碎機(jī)冰箱離心機(jī)圓底燒瓶試管實(shí)驗(yàn)步驟預(yù)處理揀選蟬蛻清洗除雜3～4次，反復(fù)漂洗，直至水澄清。將樣品放在報(bào)紙上攤開，置于60℃鼓風(fēng)枯燥箱中恒溫鼓風(fēng)加熱枯燥8h，稱重。高速粉碎機(jī)粉碎，粉碎后樣品過篩備用。提取〔水提醇沉〕稱取蟬蛻藥材細(xì)粉8g于250mL圓底燒瓶。按固液比1∶20加蒸餾水，回流提取3次，每次1h。合并提取液，濃縮至藥液比1∶1，參加95%乙醇至含醇量90%。?置冰箱中放置過夜后4500r/min離心15min。?取上清液回收枯燥，即得蟬蛻90%水提醇沉物殘?jiān)菰?，即得醇沉渣。純化取樣品濃縮液，用2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)其PH 至3，放置過夜，在3000r/min條件下離心，棄去沉淀即脫去蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)觀察預(yù)處理后用堿溶液提取法提取蟬蛻多糖。具體方法：將處理后的蟬蛻參加2倍體積的1mol/LNaOH,在100℃水浴中加熱1h，過濾收集濾液，在濾渣中參加2倍體積的1mol/LNaOH,在100℃水浴中加熱1.5h，過濾收集濾液,重復(fù)此操作3次，每次重復(fù)分別增加0.5h，最后合并濾液。100℃水浴濃縮至原體積0.2倍，參加3倍體積的冰凍無水乙醇，4℃過夜，6000r/min離心10min棄上清液，沉淀用蒸餾水溶解，沸水浴濃縮，無水乙醇沉淀，離心除去有機(jī)溶劑,收集沉淀，50℃枯燥至恒重即為蟬蛻多糖。共進(jìn)展3批次平行實(shí)驗(yàn)。1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取105

℃烘干至恒重的葡萄糖50mg于500ml容量瓶中配成0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水分別配成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml。1ml標(biāo)準(zhǔn)液分別參加5%苯酚溶液1ml，并迅速參加濃硫酸5ml，靜置10min。搖勻，30℃放置30min后于490nm測(cè)定OD值。?以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，制作得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。2\樣品含量測(cè)定：吸取1.0ml樣品液，按照上述步驟操作測(cè)定OD490，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的總糖含量。蟬蛻多糖的別離純化摘要：目的：本實(shí)驗(yàn)是從蟬衣中提取多糖,并研究蟬蛻多糖的性質(zhì)。方法：將蟬衣去除雜質(zhì)，使用膜超濾對(duì)多糖進(jìn)展別離提取，進(jìn)展脫鈣、脫蛋白、脫乙酰等處理；采用酸堿滴定法測(cè)定脫乙酰度,超離心法測(cè)定提取多糖的純度,凝膠色譜法粗略測(cè)定多糖的相對(duì)分子質(zhì)量,硫酸蒽酮法測(cè)定多糖的總含量。結(jié)果:蟬衣多糖的平均提取率為---，脫乙酰度為---，蟬衣多糖的純度,--相對(duì)分子質(zhì)量為---,多糖的總含量為---結(jié)論：蟬衣多糖易提取,且純度較高,具有研究?jī)r(jià)值。關(guān)鍵詞:蟬蛻;多糖;提取蟬蛻(Periostracumcicadae，PC)為蟬科昆蟲黑蚱CryptotympanapustulataFabricius的假設(shè)蟲羽化時(shí)的蛻殼［1］，別名蟬衣蟬蛻蟬殼知了殼［2］首載于名醫(yī)別錄，蟬蛻性甘寒，味咸，是一種常用中藥，具有散風(fēng)解熱清肺利咽解表透疹解毒消炎清肝明目，安神定志止咳平喘息風(fēng)止痙明目退翳之成效［3，4］，現(xiàn)代藥理學(xué)研究說明，蟬蛻除具有解熱鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜抗驚厥解痙等作用外，還具有一定的抗凝作用，如蟬蛻水提液可顯著降低高脂血癥大鼠紅細(xì)胞聚集指數(shù)，抵抗體外血栓形成，并能明顯緩解哮喘的微觀血瘀狀態(tài)［5］。隨著科學(xué)技術(shù)的開展，其成效不斷地被發(fā)現(xiàn)，且效果明顯，現(xiàn)代藥效學(xué)證實(shí),本實(shí)驗(yàn)對(duì)蟬蛻的多糖進(jìn)展提取別離，為研究蟬蛻的有效成分提供根底數(shù)據(jù)。1試劑與儀器2方法2.1預(yù)處理［6］揀選蟬蛻清洗除雜3～4次，反復(fù)漂洗，直至水澄清。將樣品放在報(bào)紙上攤開，置于60℃鼓風(fēng)枯燥箱中恒溫鼓風(fēng)加熱枯燥8h，稱重。高速粉碎機(jī)粉碎，粉碎后樣品過篩備用。2.2多糖的別離提取預(yù)處理后采用微波浸提［7］的方法提取蟬蛻多糖。具體方法：將處理后的蟬蛻參加10倍體積的蒸餾水，，微波功率700W、微波處理時(shí)間6min，然后4000r/min離心處理10min，收集上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮至原體積的10%。將濃縮液參加其3倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，靜置6h以上，4000r/min離心10min，收集沉淀，冷凍枯燥得粗多糖。取樣品濃縮液，用2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)其PH 至3，放置過夜，在3000r/min條件下離心，棄去沉淀即脫去蛋白質(zhì)。氧化脫色：以濃氨水或NaOH液調(diào)至PH8.0左右，50℃以下滴加H2O2至淺黃色，保溫2小時(shí)。依次用丙酮、無水乙醚和無水乙醇洗滌多糖，即可得到較為純潔的多糖。此法較為簡(jiǎn)單，便于操作，多糖損失也較小。2.3蟬衣多糖的脫乙酰［8］稱取一定量制得的蟬衣多糖放入燒杯中，然后參加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的NaOH溶液，液固比為20：1(mL·g)，于100℃攪拌反響5h，反響完畢后過濾，將所得固體洗至中性，烘干，即得脫乙酰蟬衣多糖。3多糖的測(cè)定3.1蟬衣多糖脫乙酰度的測(cè)定采用酸堿滴定法測(cè)定蟬衣多糖樣品的脫乙酰度。準(zhǔn)確稱取脫乙酰蟬衣多糖0.3g～0.5g的樣品3份,放入250mI錐形瓶中，參加0.1mol/I的鹽酸30mI,使其完全溶解,如太粘稠可加適量水稀釋。以甲基橙一苯胺藍(lán)為指示劑,用0.1mol/I的NaOH溶液滴定至終點(diǎn)(顏色由紫紅變?yōu)樗{(lán)綠)，按下式計(jì)算脫乙酰度：9.94％理論氨基的含量式中：C1:Hcl溶液的濃度(mol·I-1)；C2:標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的濃度(mol·I-1)；v1：參加的HC1溶液的體積(mI)；V2：消耗標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積(mI)；G：試樣重(g)；W：試樣含水量(％)；0.016：與lmol·I-1HcllmI相當(dāng)?shù)陌被?g)。3.2多糖含量的測(cè)定利用蒽酮硫酸法進(jìn)展多糖含量的測(cè)定．２ｇ/Ｌ蒽酮試劑的配制：?。玻巛焱芙獾剑?％Ｈ２ＳＯ４中，并以８0％Ｈ２ＳＯ４定容到１000ｍＬ，當(dāng)日配制使用．０.1ｇ/Ｌ葡萄糖溶液的配制：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖０.01ｇ，用少量蒸餾水溶解后定容至１00ｍＬ容量瓶中．精細(xì)稱?。?１ｇ／Ｌ葡萄糖溶液０.10，０.20，０.30，０.40，０.60，０.80ｍＬ至６支試管中，然后將每支試管中溶液用蒸餾水補(bǔ)足至1ml，混勻；參加４.00ｍＬ蒽酮試劑，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起用玻璃球?qū)⒐芸谏w住，浸于沸水浴中，自水浴重新煮沸起，準(zhǔn)確煮沸10min，取出，流水冷卻，室溫放置10min左右，測(cè)620nm處吸光度值．以蒸餾水作為空白樣品對(duì)照，以620nm處吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取0.1g蟬蛻多糖，用無菌水配制濃度100?ug/ml的10ml溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中的多糖含量。3.3多糖的純度鑒定利用超離心法對(duì)多糖的純度進(jìn)展鑒定，準(zhǔn)確稱取0.1g蟬蛻多糖，用無菌水配制濃度100?ug/ml的10ml溶液,在3000r/min離心20min,在離心力場(chǎng)作用下形成單一區(qū)帶,說明所含多糖較單一。1安磊.蟬蛻的抗驚厥作用.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，4(15):35～36.2牛躍華，陳錫林.中藥蟬蛻傳統(tǒng)應(yīng)用和現(xiàn)代研究概況.**臨床醫(yī)學(xué)，2000，2(4):281～282.3冷丁.蟬蛻的藥用.醫(yī)藥與保健，2001，12:16.4肖鳳雙，蘇素文，王永梅.蟬蛻治療咳喘臨床應(yīng)用舉隅.**中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2007，22(4):17.5王永梅，*樹楠，*美玉等．蟬蛻對(duì)哮喘大鼠模型支氣管和肺組織形態(tài)學(xué)及血清中T*B2和6－Keto－PGF1的影響［J］．中藥藥理及臨床，2007，23(6):45－47．6王玨,田強(qiáng)強(qiáng),陶剛等.蟬蛻活性成分的