核酸擴(kuò)增檢測標(biāo)本

采集、運(yùn)輸、存儲的重要性臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量保證關(guān)鍵性環(huán)節(jié)解決涉及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的醫(yī)患糾紛的方法之一第一頁，共54頁。核酸提取的重要性核酸提取是臨床PCR檢驗(yàn)最為關(guān)鍵的部分，亦是手式操作的主要部分核酸提取的成敗關(guān)系到臨床PCR檢驗(yàn)的正確與否臨床PCR檢驗(yàn)操作中最易出問題的環(huán)節(jié)第二頁，共54頁。分析前質(zhì)量控制

——標(biāo)本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、預(yù)處理、儲存等第三頁，共54頁。標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存早特別是對用于病毒分離、抗原或核酸檢測的標(biāo)本快標(biāo)本應(yīng)盡快送檢，不能及時檢測的標(biāo)本放入低溫容器內(nèi)送檢。短時間可低溫保存，凍存的標(biāo)本忌反復(fù)凍融近標(biāo)本應(yīng)盡量取自病變部位或接近病變部位多標(biāo)本的量不能太少凈避免污染標(biāo)本第四頁，共54頁。標(biāo)本采集標(biāo)本采集時間對擴(kuò)增檢測結(jié)果的影響標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備標(biāo)本的類型和采集量采樣質(zhì)量的評價采樣及運(yùn)輸容器標(biāo)本采集中的防污染

第五頁，共54頁。標(biāo)本運(yùn)送樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測實(shí)驗(yàn)室。樣本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑,如用于RNA測定加入GITC的血清(漿)樣本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等,則可在室溫下運(yùn)送或郵寄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床樣本的運(yùn)送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。第六頁，共54頁。檢測標(biāo)本類別全血標(biāo)本血漿血清骨髓活檢組織腹水胸水石蠟切片分泌物新鮮組織毛囊有目的地選擇標(biāo)本類別第七頁，共54頁。標(biāo)本采集器皿標(biāo)本采集器標(biāo)本類型決定標(biāo)本采集器第八頁，共54頁。標(biāo)本采集外周血（HBV/EBV-DNA、HCV-RNA、HLA分型等）抗凝劑使用：首選EDTA或枸櫞酸鈉，不可使用肝素（強(qiáng)烈抑制PCR反應(yīng)），不可溶血RNA檢測：及時分離血漿，置于無RNase的離心管中送檢EBV-DNA檢測（小心使用）：小心分離LC，避免混入RBC第九頁，共54頁。標(biāo)本采集其他體液（TB/EBV-DNA等病原）痰：深部痰液，不是唾液胸腹水：無菌抽取，加抗凝劑尿液：尿道口消毒，中段尿鼻咽部：咽后壁分泌物EBV-DNA分泌物（CT/UU/HPV-DNA等病原）采樣時要采到上皮細(xì)胞充分洗滌拭子第十頁，共54頁。切片組織標(biāo)本采集腫瘤組織>40%：直接提取核酸腫瘤組織<40%：必須采用其它方式第十一頁，共54頁。標(biāo)本保存&運(yùn)輸（人）標(biāo)本采集后不得存放于護(hù)士站過夜血液標(biāo)本/體液等：檢測DNA，采集后1h內(nèi)送檢，檢測RNA，立即送檢（30分鐘內(nèi)）活檢組織：檢測DNA，2h內(nèi)送檢，檢測RNA，立即送檢（30分鐘內(nèi)）石蠟切片：24h內(nèi)送檢第十二頁，共54頁。標(biāo)本保存&運(yùn)輸（病原體）采血后不得長期存放于護(hù)士站過夜病原DNA檢測：不超過6h，2h內(nèi)分離血漿/血清短期保存：4℃

長期保存：-20℃病原RNA檢測：采血后盡快分離血漿&提取RNA

短期保存：-20℃，避免反復(fù)凍融長期保存：-70℃，避免反復(fù)凍融第十三頁，共54頁。標(biāo)本長期保存和建庫液氮罐超低溫冰箱/柜低溫冰箱/柜常溫冰箱適當(dāng)溫度保存標(biāo)識清楚、記載詳細(xì)保存時間信息化管理第十四頁，共54頁。分析中質(zhì)量控制—核酸提取DepartmentofHealthandHumanServices,CentersforMedicareandMedicaidServices.Clinicallaboratoryimprovementamendmentsof1988;finalrule.57FederalRegister7170(codifiedat42CFR493.1265);57FederalRegister7176(codifiedat42CFR493.1445(e)(5).第十五頁，共54頁。核酸提取DNA

以正常人同類標(biāo)本做對照不同標(biāo)本類型采用不同提取方法

4℃保存，長時間-20℃保存RNA

以正常人同類標(biāo)本做對照不同標(biāo)本類型采用不同提取方法

嚴(yán)格按照操作手冊，避免降解

-20℃保存，長時間-70℃保存制定標(biāo)準(zhǔn)化的核酸提取文件第十六頁，共54頁。實(shí)驗(yàn)操作手工操作為主，固定人員，熟練操作，保持手法的一致性不同廠家提取試劑盒不可混用按質(zhì)量管理手冊進(jìn)行第十七頁，共54頁。樣品核酸提取的發(fā)展方向酚氯仿/乙醇沉淀Chelex煮沸玻璃奶吸附硅膠膜/離心柱磁珠法√√第十八頁，共54頁。樣品核酸提取的發(fā)展方向高得率高純度低拷貝樣品的檢出，PCR試劑的高靈敏度多重PCR；無雜質(zhì)，PCR不會被抑制穩(wěn)定均一可靠的檢驗(yàn)結(jié)果自動化高效提取，高通量，一體化未來核酸提取技術(shù)的必備要素第十九頁，共54頁。一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理靶核酸可以與宿主細(xì)胞整合，核內(nèi)游離及胞漿內(nèi)各種構(gòu)形存在于細(xì)胞內(nèi)，如測定的是病原微生物,則靶核酸存在于細(xì)菌、病毒、原蟲或真菌細(xì)胞內(nèi)，如果上述細(xì)胞破裂,則靶核酸亦可存在于細(xì)胞外。一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細(xì)胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。第二十頁，共54頁。核酸的分離純化核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴(kuò)增的物質(zhì)去除。經(jīng)典方法硅吸附法對于商品核酸提取試劑盒，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進(jìn)行評價。第二十一頁，共54頁。DNA提取的經(jīng)典方法即所謂的”酚-氯仿提取法”

第二十二頁，共54頁。RNA提取的獨(dú)特性臨床標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中,存在大量對RNA具有強(qiáng)烈降解作用的RNase，而RNase較耐高溫,不易失活。如何避免RNase對標(biāo)本的污染及防止RNase對提取的RNA的降解,是保證RNA成功提取的關(guān)鍵之所在。第二十三頁，共54頁。

RNA提取所用器皿的處理經(jīng)高壓滅菌的一次性使用的塑料制品如試管,離心管等基本上無RNase,可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA.實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染,使用前必須于180℃干烤8小時以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯,試管和其它用品。DEPC是RNase的強(qiáng)烈抑制劑。灌滿DEPC的器皿于37℃下放置2小時，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。第二十四頁，共54頁。RNA提取所用溶液的準(zhǔn)備

對于RNA提取所需溶液的配制,必須用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液,用干烤過的藥匙稱取試劑,將溶液裝入無RNase的玻璃器皿?？赡艿脑?溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37℃至少處理12小時,然后于100℃加熱15分鐘或高壓蒸汽滅菌15分鐘。須注意的是,DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng),因此不能用來處理含有Tris一類的緩沖液,因此可存幾瓶新的,未開封的Tris試劑以制備無RNase的溶液。第二十五頁，共54頁。RNA提取中RNase污染的控制實(shí)驗(yàn)操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來源。策略是：

在準(zhǔn)備用于RNA純化的實(shí)驗(yàn)材料和溶液時,以及在涉及RNA的整個提取操作過程中,都應(yīng)戴一次性手套。

在RNA提取實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)勤換手套。第二十六頁，共54頁。RNA提取的常用方法

表面活性劑加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。胍鹽提取結(jié)合氯仿-酚抽提法。胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸浮吸附法等。第二十七頁，共54頁。核酸提取的改良方法旋轉(zhuǎn)離心柱（SPINCOLUMN）方法玻璃粉吸附法二氧化硅（Se）或硅藻吸附法微量全血核酸提取法：NaI方法其它方法：疏水性Immobilon-P膜、全自動核酸純化儀第二十八頁，共54頁。旋轉(zhuǎn)離心柱（SPINCOLUMN）屬于硅吸附方法的一種。在原理上現(xiàn)行的旋轉(zhuǎn)離心柱系統(tǒng)通?？煞譃槿齻€部分：第一部分是利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來；第二部分是把釋放的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，當(dāng)然這種載體只對核酸有較強(qiáng)的親和力和吸附力而對其它的生化組分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則不相親和也不吸附；第三部分是把吸附在特定載體上的核酸洗脫下來，從而得到純化的核酸。

第二十九頁，共54頁。臨床標(biāo)本中PCR反應(yīng)抑制物內(nèi)源性的

:免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代謝產(chǎn)物、白細(xì)胞內(nèi)的乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類、粘蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。

外源性的

:如肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、過度UV照射后的礦物油、手套滑石粉、標(biāo)本容器或采樣器材上含有的抑制物。注意事項第三十頁，共54頁。肝素的作用機(jī)理

肝素對MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和TAQDNA聚合酶均很強(qiáng)的抑制作用，如果臨床標(biāo)本為肝素抗凝，則在核酸純化過程中，標(biāo)本中的肝素可結(jié)合于DNA和RNA上，盡管肝素和核酸本身都帶正電荷。對標(biāo)本進(jìn)行煮沸、凝膠過濾、酸堿處理后凝膠過濾、反復(fù)乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用。每μg核酸標(biāo)本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制酶活性。在標(biāo)本中加入肝素酶I或Ⅱ1~3U/μg核酸(于5mMTrispH7.5,1mMCaCl2,40URNasin25℃2小時)可去除肝素的抑制作用。第三十一頁，共54頁。血紅蛋白、乳鐵蛋白（lactoferrin）血紅蛋白和乳鐵蛋白分別是紅細(xì)胞和白細(xì)胞內(nèi)的主要PCR抑制物,它們均含有鐵。抑制機(jī)制可能是：1）與這些蛋白釋放鐵離子至PCR混合物中有關(guān)。研究鐵的抑制效應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)其干擾DNA合成，而且膽紅素、膽鹽和氯化高鐵血紅素（Hemin）等血紅蛋白衍生物，也是PCR抑制物。2）亞鐵血紅素(Heme)可通過返饋抑制調(diào)節(jié)DNA聚合酶活性及協(xié)調(diào)紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白成分的合成。也觀察到，氯化高鐵血紅素通過直接作用于DNA聚合酶，與成為一個與靶DNA競爭的抑制劑和核苷酸的非競爭性抑制劑。3）由于靶核酸DNA被血液中大量的凝血有機(jī)物質(zhì)包裹所致，使得靶DNA不能接觸DNA聚合酶。第三十二頁，共54頁。血紅蛋白1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性，與Mg2+濃度無關(guān)。Tth聚合酶在含4%（V/V）血液的PCR反應(yīng)混合液中可以進(jìn)行擴(kuò)增，加入1U單鏈DNA結(jié)合蛋白——T4基因32蛋白(gp32)，Tth聚合酶在含8%（V/V）血液情況下，仍可擴(kuò)增。因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可實(shí)現(xiàn)從臨床標(biāo)本不提取純化核酸直接擴(kuò)增靶DNA。不同的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶對臨床標(biāo)本中的抑制物的敏感性不一樣。第三十三頁，共54頁。IgG

IgG的抑制作用是由于其與單鏈DNA的相互作用，使得靶DNA不能與DNA聚合酶相互作用使用煮沸作為標(biāo)本處理方法或使用PCR前的熱啟動,將增強(qiáng)IgG對PCR反應(yīng)的抑制第三十四頁，共54頁。去除或減輕抑制的一些方法NaOH處理可中和臨床標(biāo)本中的TaqDNA聚合酶抑制劑，但這種方法不適用于DNA含量低的標(biāo)本，因?yàn)镹aOH處理可使DNA大量丟失。第三十五頁，共54頁。去除或減輕抑制的一些方法加入0.6%(wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液對TaqDNA聚合酶的抑制效應(yīng)，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功擴(kuò)增，而通常血液含量只能是0.2%。BSA也可增加rTth或TaqDNA聚合酶的擴(kuò)增能力，使其對糞便和肉類標(biāo)本中抑制物的抵抗能力分別提高10和20倍。單鏈DNA結(jié)合T4基因32蛋白（gp32）有類似BSA的增強(qiáng)效應(yīng)。第三十六頁，共54頁。核酸純化核酸分離純化技術(shù)起源于二十世紀(jì)五十年代，在七十年代和八十年代中傳統(tǒng)的核酸沉淀溶解分離純化方法得到了普遍的應(yīng)用和推廣。傳統(tǒng)的核酸提取方法常涉及去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機(jī)溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。第三十七頁，共54頁。提取核酸的質(zhì)量純化的靶核酸的完整性：可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與一核酸標(biāo)準(zhǔn)比較測定。核酸提取的產(chǎn)率：可在A260讀數(shù)測定。核酸純度：可通過提取物A260/A280比率判定血清或血漿中病原體核酸純化純度：采用一種間接的方法，即使用已知病原體含量的溶血和/或脂血標(biāo)本用待評價試劑提取，然后進(jìn)行擴(kuò)增檢測，比較所得到的結(jié)果第三十八頁，共54頁。臨床標(biāo)本核酸提取中可能存在的非源自標(biāo)本的抑制和干擾物質(zhì)

核酸提取中：許多試劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢劑如十二烷基硫酸鹽(SDS)和chaotrope試劑如異硫氰酸胍和鹽酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有機(jī)溶劑。第三十九頁，共54頁。核酸樣本制備及擴(kuò)增檢測的質(zhì)控對臨床標(biāo)本中可能存在的抑制/干擾物的質(zhì)控措施核酸提取及擴(kuò)增有效性的質(zhì)控

第四十頁，共54頁。對臨床標(biāo)本中可能存在的抑制/干擾物的質(zhì)控措施質(zhì)控措施：采用內(nèi)質(zhì)控（internalcontrol,IC）（通常稱為內(nèi)標(biāo)）的方法內(nèi)標(biāo)有兩種,即競爭性的和非競爭性的內(nèi)標(biāo)。第四十一頁，共54頁。核酸提取的質(zhì)量控制提取過程質(zhì)控設(shè)立強(qiáng)陽性質(zhì)控品提取過程中加入帶顏色的內(nèi)標(biāo)設(shè)立臨界陽性質(zhì)控品各質(zhì)控品和內(nèi)標(biāo)需符合說明書標(biāo)準(zhǔn)第四十二頁，共54頁。感染性疾病的分子診斷實(shí)例1第四十三頁，共54頁。乙型肝炎病毒檢測第四十四頁，共54頁。乙型肝炎二對半檢測大三陽：1、3、5陽性小三陽：1、4、5陽性第四十五頁，共54頁。1、標(biāo)本類型：血漿、血清（血漿>血清10倍）2、陰性結(jié)果解讀：DNA陰性并非無感染，判斷是否感染需要進(jìn)行HBsAg檢測3、什么時候需要檢測HBV-DNA：a、HBsAg(+)，需要判斷HBV在體內(nèi)復(fù)制情況b、乙型肝炎患者在治療過程中療效監(jiān)測大三陽患者HBV-DNA陰性率5-10%小三陽患者HBV-DNA陰性率30%左右第四十六頁，共54頁。47丙型肝炎流行丙型肝炎呈全球性流行，是歐美及日本等國家終末期肝病的最主要原因全球約1.2億人感染HCV,流行率2%我國HCV的感染率約為3.2%，約3800萬HCV感染者每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬例----WHO第四十七頁，共54頁。丙型肝炎檢測注意事項：a、血漿、血清b、及時送檢，不能及時檢測時，放置與-20℃c、抗體檢測陽性時，HCV-RNA(+),有感染；抗體檢測陰性時，不一定未感染，需檢測HCV-