個人收集整理，勿做商業(yè)用途頒發(fā)部門微生物限度檢查操作規(guī)程接收部門見效日期操作標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量擬定人擬定日期文件編號審察人審察日期文件頁數(shù)共6頁贊同人贊同日期發(fā)散部門目的建立微生物限度檢查的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，保證檢驗(yàn)結(jié)果的正確性。范圍適用于本廠質(zhì)監(jiān)科化驗(yàn)室對本廠生產(chǎn)的固系統(tǒng)劑及物料進(jìn)行微生物限度的檢查。責(zé)任化驗(yàn)員有責(zé)任依據(jù)本操作規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)、判斷,并對檢驗(yàn)結(jié)果負(fù)責(zé)。定義微生物限度檢查法系指非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料碰到微生物污染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。內(nèi)容5.1總則：供試品應(yīng)隨機(jī)抽樣。一般抽樣量為檢驗(yàn)用量（2個以上最小包裝單位）的倍量。5.1.2供試品在檢查前不得開啟，檢查全過程均應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，嚴(yán)防再污染。5.1.3控制菌的污染檢查應(yīng)做相應(yīng)的已知菌比較試驗(yàn)，比較菌株為大腸桿菌（[B）44102]，每批試驗(yàn)已知菌加入量為50-100個。5.1.4染菌量的檢查或控制菌的檢查均應(yīng)做空白比較試驗(yàn)。5.1.5供試品稀釋成稀釋液后應(yīng)在平均狀態(tài)下取樣，凡有抑菌成份或防腐劑的供試品應(yīng)做特別辦理后進(jìn)行檢驗(yàn)。5.1.6供試品稀釋后應(yīng)在1小時內(nèi)操作達(dá)成。個人收集整理，勿做商業(yè)用途第2頁/共6頁5.1.7除還有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)溫度為30-35℃，霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為25-28℃，控制菌培養(yǎng)溫度為36℃±1℃。5.1.8細(xì)菌、霉菌檢驗(yàn)結(jié)果的報告以1g、1或102為單位；控制菌檢驗(yàn)報告以每1g、每1或每102為單位報告“檢出”或“未檢出”。5.2儀器、用具恒溫培養(yǎng)箱、隔水式生化培養(yǎng)箱、電子天平，移液管(1、10)、試管、離心管、雙碟、鑷子、剪刀、不銹鋼吸管筒、酒精燈、取樣勺、稱量紙、研缽一個、不銹鋼雙碟筒。5.2.1用具的包扎移液管：用紗布包住移液管，爾后放入不銹鋼滅菌筒內(nèi)。試管、雙碟：試管在管口塞上紗布棉塞、雙碟放入不銹鋼雙碟筒內(nèi)。無菌衣、褲、帽、口罩：用布口袋將洗凈的衣褲、帽子、口罩配套后裝入，扎緊袋口，再用牛皮紙包好。5.2.2用具的滅菌將包扎好的用具，在121±0.5℃蒸汽滅菌柜中滅菌30分鐘，物品取出時切勿馬上置冷處，省得急速冷卻滅菌物品內(nèi)蒸汽凝造成負(fù)壓，易致染菌，應(yīng)置烘箱烘干。5.3培養(yǎng)基、試劑5.3.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基稱取本品36克，加1升蒸餾水，加熱溶解后，按需要進(jìn)行分裝，經(jīng)121℃分鐘滅菌備用。虎紅培養(yǎng)基稱本品30克，加1升蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌116℃20分鐘。膽鹽乳糖培養(yǎng)菌（）稱本品36克，加1升蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌116℃20分鐘。曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（）稱本品42克，加1升蒸餾水，加熱溶解，分裝，高壓滅菌116℃20分鐘。生理鹽水稱取9g氯化鈉，加水1000溶解，分裝后于121℃±0.5℃濕熱滅菌30分鐘，供作稀釋劑用。75%酒精棉量取無水乙醇75，加水稀釋至100，搖勻，將脫脂棉與75%酒精混雜即得。5.3.70.1%新潔而滅第3頁/共6頁個人收集整理，勿做商業(yè)用途量取5%新潔而滅20，加水稀釋至約1000，搖勻，即得。5.4進(jìn)入無菌室的操作要點(diǎn)用肥皂水洗手，換消毒鞋，關(guān)閉緩沖間紫外燈，將用具物品搬入傳達(dá)窗口內(nèi)，用紫外燈滅菌15分鐘，關(guān)閉第一層門，用1%新潔而滅沖洗雙手，用消毒毛巾擦干，換上無菌衣、褲、帽子、口罩及消毒鞋。關(guān)閉無菌室內(nèi)紫外燈，進(jìn)入第二層門并將用具搬至無菌室內(nèi)，關(guān)閉無菌室門。凡進(jìn)入無菌室后不應(yīng)再出門取物品，因此，在每次試驗(yàn)中所用物品必定計(jì)劃好，并準(zhǔn)備好備用物品。從進(jìn)入第一層門直至無菌室內(nèi)，隨工作人員的進(jìn)入就噴霧0.1%新潔而滅溶液。5.5檢查法：5.5.1細(xì)菌、霉菌的染菌量，采用培養(yǎng)皿菌落計(jì)數(shù)法。供試液的制備：固體供試品以無菌操作稱取10g，置含0.9%氯化鈉的生理鹽水100中，振搖溶解，使成1:10稀釋度的供試液。爾后吸取1:10的供試液1，置含0.9%氯化鈉的生理鹽水9中，稀釋成1:100稀釋度的供試液。依次可制成1:1000的供試液。吸樣：分別吸取1:10、1:100、1:1000的供試液1分別注入2-3個平皿中。注皿：將早先融化并置45℃水浴中保溫備用的細(xì)菌、霉菌培養(yǎng)基分別傾注入平皿，每皿約15，隨即轉(zhuǎn)動平面，使供試液與培養(yǎng)基混勻，分別作上標(biāo)記，置水平臺上待凝。同時作空白比較（不加樣品，將兩個雙碟分別加入虎紅培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，操作同上）。培養(yǎng)：培養(yǎng)

將凝固好的平皿按規(guī)定溫度倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌培養(yǎng)72小時。

48小時；霉菌菌落形態(tài)細(xì)菌菌落是一個菌細(xì)胞或菌細(xì)胞團(tuán)在限制地址上，經(jīng)必然條件下生殖成肉眼可見的細(xì)菌集體，外觀濕潤或干燥，表面圓滑或折皺，外緣整齊或弊端。擁有放射或樹枝樣分枝的菌絲是霉菌菌落的特色。初形成時多無色透明，有明顯的折光性，成熟的霉菌菌落有各種顏色的孢子形成。在較暗的背景下以透射光觀察，易于鑒別。菌落計(jì)數(shù)法：先用肉眼觀察，標(biāo)記并計(jì)數(shù)，爾后用5-10倍放大鏡檢查有無遺漏。第4頁/共6頁個人收集整理，勿做商業(yè)用途如有片狀菌落或花斑樣菌落延長生長的以及平板碰到污染的情況，則該平板計(jì)數(shù)無效。若平板上有2個也許2個以上的菌落重疊，如可辯白，仍以2個或是2個以上菌落計(jì)數(shù)。當(dāng)一個稀釋級用2個平板時，應(yīng)采用2個平板菌落數(shù)的平均值。計(jì)算各稀釋級的平均菌落數(shù)按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于報告菌數(shù)為小于10個。

1時，則菌數(shù)報告規(guī)則：細(xì)菌宜采用平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋級，霉菌宜采用平均菌落數(shù)在30～100之間的稀釋級作為報告菌數(shù)計(jì)算的依據(jù)。如有1個稀釋級在30～300（30～100）之間時，將該稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；仿佛時有釋級在30～300（30～100）之間時，按下式計(jì)算兩級比值。高稀釋級的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)比值=—————————————————低稀釋級的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)

2個稀當(dāng)比值≤2時，以兩稀釋級的均值報告，當(dāng)比值>2時，以低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；仿佛時有3個稀釋級的平均菌落數(shù)均在30～300之間時，今后2個稀釋級計(jì)算級間比值報告；如各稀釋級的平均菌落數(shù)均不在30～300以最湊近30或300的稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如各稀釋級平均菌落數(shù)均在300（100）以上，按最高稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如各稀釋級平均菌落數(shù)均小于30時，一般按最低稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。5.5.2控制菌的檢查：除還有規(guī)定外，取供試液10（相當(dāng)于供試品1g、1、102），直接或辦理后接種，經(jīng)增菌、分別培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭染色、生化試驗(yàn)與血清凝集試驗(yàn)等項(xiàng)檢查。大腸桿菌檢查法：取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100，2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入比較菌50-100個作陽性比較，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性比較。培養(yǎng)18-24小時（必要時可延至48小時）。陰性比較應(yīng)無菌生長。取上述3份的培養(yǎng)物各0.2，分別接種至5培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5小時與24小時時，取未接種的培養(yǎng)基管作本底比較，將各管置365紫外光下觀察。陽性比較管表現(xiàn)熒光，陽性。供試液的管表現(xiàn)熒光，陽性；無熒光，陰性。爾后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。當(dāng)陰性比較呈陰性，陽性比較正常生長，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液澄第5頁/共6頁個人收集整理，勿做商業(yè)用途明，并證明無菌生長，判未檢出大腸桿菌。如陽性、靛基質(zhì)陰性，或陰性、靛基質(zhì)陽性，均應(yīng)取供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍(lán)（）瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)18-24小時，如上述供試液培養(yǎng)物的分別平板無菌落生長，判未檢出大腸桿菌。或有菌落生長，應(yīng)優(yōu)選2-3個可疑菌落依據(jù)藥典規(guī)定作生化試驗(yàn)及革蘭染色、鏡檢，并按規(guī)定判斷結(jié)果。大腸桿菌菌落形態(tài)在瓊脂平板上的典型菌落呈紫黑色或中心深紫色，圓形，稍突出，邊緣整齊，表面圓滑，帶有金屬光彩。非典型形態(tài)，在瓊脂平板上呈淺紫、粉紫、粉色，無明顯的暗色中心，應(yīng)做為疑似菌進(jìn)行判斷。5.5.3比較試驗(yàn)：陰性比較試驗(yàn)：檢驗(yàn)試驗(yàn)全過程無菌技術(shù)的可靠性。菌數(shù)測定陰性比較試驗(yàn)分別吸取生理鹽水1置于無菌平皿中，分別按細(xì)菌、霉菌測定方法注皿、培養(yǎng)，不得長菌。控制菌檢查陰性比較試驗(yàn)吸取生理鹽水于增菌液中，按控制菌檢查方法檢查不得長菌。陽性比較試驗(yàn)：檢查供試品可否對控制菌生長產(chǎn)生攪亂作用及檢查培養(yǎng)條件可否合適。方法：于供試液中加入必然量的相應(yīng)比較菌，做平行試驗(yàn)。規(guī)定陽性比較菌株為大腸桿菌[（B）44102]。比較菌的加入量為50-100個，可早先預(yù)試確定。用計(jì)數(shù)方法，取37℃培養(yǎng)18-20小時的新鮮肉湯培養(yǎng)物，以10倍遞增稀釋至10-6,取其0.1于一般肉湯瓊脂板表面涂抹進(jìn)行測定。當(dāng)供試品未檢出菌時，而陽性比較試驗(yàn)也未能檢出，則不能夠做出供試品未檢出控制菌的結(jié)論。陽性比較試驗(yàn)操作必定與供試品檢驗(yàn)操作嚴(yán)格分開，防備交織污染。5.6復(fù)試：5.6.1菌數(shù)測定不合格者應(yīng)復(fù)試，控制菌檢驗(yàn)以一次檢驗(yàn)為準(zhǔn)，不再復(fù)試，但應(yīng)保留檢出菌株一個月備查。5.6.2復(fù)試項(xiàng)目以不合格項(xiàng)目為準(zhǔn)，做單項(xiàng)復(fù)試。5.6.3復(fù)試需取同批樣品測定2次。5.6.4復(fù)試報告以3次測定結(jié)果的算術(shù)平均值報告。第6頁/共6頁個人收集整理，勿做商業(yè)用途5.7檢驗(yàn)報告：5.7.1測定菌數(shù)報告：以各次測定結(jié)果的全部平均值報告。控制菌以一次檢驗(yàn)的結(jié)果報告：報告為檢出或未檢出控制菌。培訓(xùn)6.1培訓(xùn)對象：化驗(yàn)員。6.2培訓(xùn)時間：二小時。7記錄記錄名稱保留部門保留時間微生物限度檢驗(yàn)記錄質(zhì)監(jiān)科藥品有效期后一年01-006-00個人收集整理，勿做商業(yè)用途微生物限度檢驗(yàn)記錄品名：批號：規(guī)格：檢驗(yàn)日期：年代日細(xì)菌計(jì)數(shù)30～35℃4