分子細(xì)胞遺傳學(xué)原位雜交(Insituhybridization)

1）同位素原位雜交(Isotopicinsituhybridization)

——70年代

2）非同位素原位雜交(Non-isotopicinsituhybridization)

——80年代中后期

（1）免疫酶聯(lián)

（2）熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH)

**同位素原位雜交的不足之處：

1）不穩(wěn)定；

2）低特異性；

3）高背景；

4）暴光時(shí)間長(zhǎng)；

5）結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理繁瑣。

LichterP.CremerT.WardD.C.**熒光原位雜交的特點(diǎn)：

1）快速；2）信號(hào)強(qiáng)；3）特異性高；4）多色。

**FISH有上述優(yōu)點(diǎn)的原因：

1）使用了熒光標(biāo)記與檢測(cè)系統(tǒng)取代放射性標(biāo)記與檢測(cè)系統(tǒng)

標(biāo)記探針的物質(zhì)：（1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin)

——半抗原報(bào)告分子（間接標(biāo)記）

（2）熒光物質(zhì)（直接標(biāo)記）

Cy2或FluorX(綠色)/Cy3(橙色)/Cy3.5(猩紅色)/Cy5(紅色)/Aqua(蘭色)

間接標(biāo)記的信號(hào)檢測(cè)（抗biotin或digoxigenin抗體上連接熒光物質(zhì)）物質(zhì)：

conjugatedtoavidinorantibodyofdigoxigenin

(1)Fluoresceinisothiocyanate(FITC)或Bidopy——綠色

(2)TexasRed,Rhodamine,——紅色

(3)AMCA——蘭色

染色體復(fù)染的物質(zhì):

PropidiumIodide(PI)（紅色），DAPI（蘭色），quinacrine（綠色），chromomycineA3（綠色）

2）染色體“原位抑制”雜交（chromosomeinsitusuppression,CISS)

克服散在的重復(fù)序列造成的雜交背景，提高信號(hào)的特異性，在探針中加入過(guò)量的未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性DNA(competitorDNA)，如humanCot-1DNA，進(jìn)行雜交前的預(yù)復(fù)性。探針中的重復(fù)序列與加入的競(jìng)爭(zhēng)物中的大量重復(fù)序列優(yōu)先復(fù)性，而特異性的單拷貝序列因競(jìng)爭(zhēng)物中同源序列拷貝數(shù)少，絕大部分仍保持單鏈狀態(tài)。

**FISH技術(shù)的應(yīng)用

1）基因（或DNA片段）的染色體定位；

2）染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)異常的檢測(cè)；

3）間期細(xì)胞遺傳學(xué)（絨毛/羊水/精子/卵裂球/其它間期細(xì)胞研究與診斷）；

4）腫瘤遺傳學(xué)研究**用于FISH的探針

1）單拷貝探針：

（1）種類：YAC，BAC，Cosmid，Plasmid，cDNA片段

（2）應(yīng)用

（a）定位DNA片段及嵌合體克隆驗(yàn)證；

（b）確定染色體微小缺失與重復(fù)；

（c）染色體斷裂點(diǎn)分析。

（d）間期細(xì)胞染色體數(shù)目異常診斷。左：DNA片段的染色體定位右：嵌合體檢出染色體片段重復(fù)Dup19(p13.2-13.1ABABDirectDupNormalNormal左圖：染色體斷裂點(diǎn)分析

——21號(hào)染色體長(zhǎng)臂斷裂點(diǎn)精確定位

右圖：21q22.2BAC克隆在Down綜合征間期細(xì)胞中的雜交信號(hào)BAC1D9on2p21DetectedAmplificationsonThyroidTumorCellLineWRO**間期細(xì)胞遺傳學(xué)的意義：

細(xì)胞分裂期僅占整個(gè)細(xì)胞周期的幾分之一至幾十分之一，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和相應(yīng)處理才能獲得染色體。人體的大部分細(xì)胞并不進(jìn)行分裂，很難通過(guò)培養(yǎng)獲得中期染色體分裂相，間期FISH為這一時(shí)期遺傳物質(zhì)的研究提供了可能，而且快速。3）染色體涂染探針(chromosomepaintingprobes)

整條染色體探針或染色體區(qū)帶特異性探針

探針來(lái)源：

（1）含有人單條染色體的人-嚙齒類(human-rodent)體細(xì)胞雜種組織融合的產(chǎn)物；

（2）熒光激活的流式細(xì)胞儀(fluorescence-activatedcellsorter,FACS)分離整條染色體DNA，并以載體克隆/PCR擴(kuò)增；

（3）顯微切割得到染色體或染色體片段，PCR擴(kuò)增；

染色體涂染方法：

（1）正向(forward)：正常probe雜交到待檢測(cè)的異常標(biāo)本上；

（2）逆向(reverse)：分離異常染色體制備探針，雜交到正常標(biāo)本上。

應(yīng)用（1）染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常分析；

（2）不同物種間的同源性比較；

（3）白血病及其它腫瘤的染色體診斷和研究。

**不能用于間期FISHFISH檢測(cè)（chromosomepainting)染色體易位4）多色FISH（muti-colorFISH)

多色復(fù)合染色體FISH探針(multiplexFISH,M-FISHprobes)

#兩種以上不同的非同位素標(biāo)記，不同的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)不同的濾光片組合或極少數(shù)幾種非同位素標(biāo)記探針后，按照不同的比例混合，可以顯示多種顏色。

#采取結(jié)合或比率標(biāo)記的方法進(jìn)行標(biāo)記探針。

在一套特殊的濾光片和計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)輔助下，可制作24條染色體的彩色核型。

應(yīng)用：(a)染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常及斷裂點(diǎn)分析——多色FISH或M-FISH

(b)標(biāo)記染色體識(shí)別——多色FISH或M-FISH

(c)不同種屬間基因組同源性比較——多色FISH

(d)多個(gè)DNA片段同時(shí)定位——多色FISH

**M-FISH不能檢測(cè)染色體內(nèi)的倒位、小片段缺失與重復(fù)。5）彩色顯帶FISH（Rx-FISH）探針

根據(jù)靈長(zhǎng)類動(dòng)物與人類基因組的同源性制作探針，使人類的24條染色體顯示出彩色帶型。**比較基因組雜交(comparativeinsituhybridization)

探針位整個(gè)基因組DNA，而不是一個(gè)點(diǎn)或一個(gè)區(qū)域，主要用于確定未知區(qū)域的DNA擴(kuò)增或缺失。特別是回避了實(shí)體腫瘤染色體制備的難題，是其它FISH方法難以替代的。但操作難度較大。

應(yīng)用：(a)腫瘤遺傳學(xué)研究——發(fā)現(xiàn)新的癌基因和抑癌基因；

(b)相關(guān)種屬間和同一種屬內(nèi)不同個(gè)體之間基因組差異；

(c)染色體不平衡片段識(shí)別和染色體重排研究。**引物原位標(biāo)記或DNA合成

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